生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略

发布时间：2020-09-04 15:34

　　为满足“资源节约型、环境友好型”社会建设和绿色工业发展对绿色净水剂的需求，生物破乳剂作为一种高效、低毒、环保的绿色净水剂，成为破乳剂领域研究的新热点。在高含水原油乳状液以及其它工业乳状液副产品的处理和处置中，应用生物破乳剂替代大量使用的化学破乳剂，对提高乳状液脱水率，降低环境污染风险具有深远意义。但是，生物破乳剂的实际应用进程受到破乳剂产生菌代谢过程不稳定、破乳有效成分复杂及缺少大规模发酵生产经验等问题的制约。基于此，开展破乳菌筛选方法；菌种破乳效能强化；粗产品分离与鉴定；发酵工艺优化及产破乳剂相关蛋白质功能解析等方面的研究，将为生物破乳剂的大规模生产、推广和应用奠定良好基础。将可用于间接表征生物破乳剂破乳效能及破乳菌初筛的6种生物表面活性剂检测方法与破乳试验相结合，提出破乳菌筛选原则，构建高效筛选模式。确定了高效破乳菌(24h排油率≥90%)的判断依据：发酵液表面张力≤40mN/m或细胞表面疏水性(MATH)≥50%。筛选得到7株高效破乳菌，经16S rDNA鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacilllus sp.)和戈登氏菌属(Gordonia sp.)，实验室编号分别为LXH-1、LXH-2、LXH-3、LL1、LL-1、LL-2和LL-3。以生物破乳剂产生菌XH1为研究对象，改进破乳菌复壮方法，其核心是通过烃类物质-液体石蜡为底物排除负变细胞，调节菌株的破乳活性；改进的复壮方法可成功将菌株XH1的表面活性、破乳功能等特性恢复至原始水平，效果优于常规复壮。研究表明烃类物质-液体石蜡对菌株XH1合成破乳有效组分具有刺激和促进作用，利用液体石蜡预先刺激强化菌种，再经生产培养基扩大培养，获得的生物破乳剂可将破乳半衰期t1/2从16h缩短为2h。根据胞外蛋白破乳比活性、细胞表面疏水性等相关试验结果，初步分析液体石蜡强化促进菌株XH1破乳特性的作用机制。菌株XH1经液体石蜡强化后，破乳有效组分主要分布于上清液和附着在菌体表面。分离得到生物破乳剂粗产品，产量为2.01g/L，4mg的排油率(24hR.D.)93%。利用可见-紫外光谱、红外光谱和薄层层析(TLC)确定粗产品主要功能组分为蛋白质和脂肽类物质；平均分子量为2.59×106Da。并从中粗提得到脂肽类物质的量为0.08±0.01g/g (24h R.D.:65.3%)；破乳活性蛋白复合物可由饱和度25%，45%的(NH4)2SO4粗提得到，产量为0.36±0.02g/g (24h R.D.:67.4%)。利用SDS-PAGE电泳和质谱技术确定疏水蛋白质Oxalate Decarboxylase为一种破乳有效蛋白质。为了提高生物破乳剂的产率，采用响应面法(RSM)确定最优培养基组成为：8.5g/L葡萄糖、3%(v/v)液体石蜡、15g/L磷酸盐(K2HPO4KH2PO4)、1.5g/L酵母膏和3.36g/L氯化铵；与优化前相比排油率(24h)提高了35.5%，破乳剂粗产品产量提高了1倍。进一步确定最佳发酵条件为：培养温度29℃、摇床转速200r/min、培养时间21h和种子液菌龄24h。为了确定破乳菌XH1的发酵方式，首先基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程及Luedeking-Piret-Like方程建立描述菌株XH1分批发酵生产破乳剂的动力学模型，经检验该组模型能较好的拟合XH1发酵过程。进一步比较不同的发酵方式，结果表明分批补料半连续式发酵优于分批发酵，最佳补料参数：初始葡萄糖为2.0g/L；补料方式为间歇式，间隔时间为5h；补料量为：控制每次补料量比前一次增加0.02%~0.04%。破乳菌XH1在最佳补料方式下破乳剂粗产品产率提高55.9%，产品对糖得率提高44%，高效破乳剂(24h排油率80%)连续生产周期延长了50h。为了确定参与生物破乳剂合成的相关蛋白质，采用SDS-PAGE电泳研究液体石蜡刺激强化培养和单一营养物质缺失对XH1破乳效能和菌体总蛋白变化的影响，获得差异表达蛋白复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。通过nanoESI-Q-TOF MS/MS共鉴定出66个差异表达蛋白质，分属于碳水化合物的转运和代谢、能量产生与转换、翻译/核糖体结构和生物合成等14个蛋白质功能。确定以上差异表达蛋白质中与糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)以及蛋白质合成相关的酶与菌株XH1合成蛋白质和脂肽类生物破乳剂关系密切，进一步从蛋白质组层面分析不同发酵条件影响菌株XH1产生物破乳剂能力的作用机制。基于以上研究结果，建立发酵工艺条件、差异蛋白质功能以及生物破乳剂合成过程三者的关系，从代谢调节、菌种特性和发酵工艺三个层面综合分析强化破乳菌XH1产破乳剂能力的策略，并提出菌种高效筛选→菌种改进复壮→液体石蜡刺激强化→半连续发酵生产的破乳菌XH1发酵形式，对于今后生物破乳剂大规模生产具有重要的参考价值。
【学位单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：X703

【参考文献】