三株鱼类细胞系的建立和十二株鱼类细胞系对重金属毒性的敏感性研究

发布时间：2020-09-10 18:10

　　水环境污染是全球关注的热点问题之一。全球每年都有大量的毒物通过各种途径进入水环境中,包括重金属在内的众多污染物对生物体都具有潜在的毒性。如果不能及时地发现毒物、检测其毒性以及对其潜在危害做出预测,那么极有可能造成严重的生态危机。因此建立灵敏、快速的生物检测体系对污染物的毒性进行早期预警和生态风险评估就显得极其重要。利用体外培养的细胞系作为体外模型进行污染物毒性检测的体外检测系统具有细胞均一性好、遗传相似、反应速度快、经济、方便等众多优点,使得其在毒理学中的应用越来越广泛。由于现在建立的鱼类细胞系的种类和数量繁多,而每种细胞系对毒物的反应又存在较大差异,因此,需要通过检测不同的污染物对不同细胞系的毒性,以确立敏感的、适合的细胞体外模型应用于其毒性早期预警的研究。本文主要研究鱼类细胞体外模型对检测我国水体中常见的四种重金属——镉(Cd)、铬(Cr)、锌(Zn)、铜(Cu)的毒性敏感性和适用性。通过比较不同培养代数、不同物种、不同组织来源的早期传代细胞系和永生性细胞系对重金属的毒性敏感性,确立每种重金属的相对敏感细胞系,然后以毒性敏感细胞系为体外模型检测重金属的细胞毒性、氧化损伤和基因毒性,探讨敏感的、适用的鱼类细胞体外模型在重金属毒性检测中的应用前景,主要研究结果如下: 1、三株鱼类细胞系的建立利用组织块贴壁法新建了胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticu)肌肉细胞系CSM与吻端组织细胞系CSSN以及稀有泩鲫(Gobiocypris rarus)鳍条细胞系RMF三株细胞系,并通过细胞计数研究其最适生长条件和冻存复苏能力,通过染色体分析和线粒体基因分析鉴定其遗传种质。结果表明新建的三株细胞系均为成纤维贴壁型细胞,形态较均一;三株细胞系均能在含10%FBS的L-15培养液及25℃的培养条件下具有连续传代能力,其中CSM的最适培养液为M199;冻存的5~(th)、10~(th)、15~(th)细胞的复苏能力较强,其复苏后存活率均在90%以上,贴壁率在50%-80%之间;染色体分析表明新建细胞系虽然存在染色体缺失与增多现象,但仍为正常四倍体细胞(染色体条数100,CSM和CSSN细胞系)和二倍体细胞(染色体条数为50,RMF细胞系);线粒体基因(12s rRNMl8s rRNA、cytb)分析表明PCR扩增的基因片段序列与其来源鱼类的发表序列完全一致。可见,新建的三株鱼类细胞系具有体外连续传代能力且未发生遗传突变,可作为早期培养细胞模型应用于水环境污染物的毒性检测。 2、十二株鱼类细胞系对检测重金属毒性的敏感性研究 (1)首先,利用MTT法(以IC50值为指标)和细胞总蛋白含量测定法(CB法)(以IC50值为指标)检测氯化镉(CdCl_2·2.5H_2O)、重铬酸钾(K_2Cr_2O_7)、氯化锌(ZnCl_2)、硫酸铜(CuSO_4·5H_2O)对草鱼CIK细胞的细胞毒性,利用彗星实验法(SCGE法)(以DNA损伤率为指标)以及PI染色流式细胞仪法(FCM法)(以细胞凋亡率为指标)检测镉、铬(Ⅵ)、锌、铜对草鱼CIK细胞的基因毒性。结果表明四种体外检测方法均能通过不同的指标定性比较重金属对草鱼CIK细胞的毒性大小,其检测出重金属的毒性大小均为Cd＞Cr＞Cu＞Zn;两种重金属细胞毒性检测方法——MTT法和CB法得到的四种重金属的IC50值无显著性差异;综合比较这四种方法的优缺点,确定了MTT法为简单、快速、重复性好的重金属毒性敏感细胞系体外检测方法。 (2)其次,利用MTT法,以IC50值为指标,比较了三株不同物种、不同组织来源、不同培养代数的新建细胞系,以及来源于不同组织、不同物种的九株永生性鱼类细胞系对重金属毒性的敏感性。结果表明随着培养代数的增加,三株新建细胞系对重金属的毒性敏感性有所下降,但在20代之内未见显著性差异;同一物种不同组织来源的鱼类细胞系对重金属的毒性敏感性是不同的;同一组织来源的不同物种的鱼类细胞系对重金属的毒性敏感性也是不同的,且早期传代细胞系不一定比永生性细胞系对重金属的毒性更敏感;确定了氯化镉的毒性敏感细胞系为斑点叉尾洶卵巢细胞系CCO,重铬酸钾和氯化锌的毒性敏感细胞系均为鲤上皮瘤细胞系EPC,硫酸铜的毒性敏感细胞系为草鱼肾脏组织细胞系CIK。 3、毒性敏感细胞系在重金属毒性检测中的应用以上述研究确定的毒性敏感细胞系作为体外模型,通过细胞形态观察,MTT法和CB法检测重金属的细胞毒性,采用脂质过氧化水平、GPX和SOD酶活性的测定检测重金属造成的氧化损伤,利用彗星实验法检测DNA的损伤,使用流式细胞法检测细胞凋亡和细胞周期的变化。结果表明重金属能引起细胞发生变圆、崩解、脱落,并抑制细胞生长,显著降低细胞存活率,引起细胞脂质过氧化物水平增加,造成细胞GPX和SOD酶活性下降,总抗氧化能力减弱,导致细胞发生氧化损伤;使细胞DNA单链发生断裂,发生DNA损伤;并引起细胞凋亡和细胞周期时相改变,且这些作用均呈浓度依赖关系。可见,确定重金属毒性敏感细胞系进行其毒性早期预警是可行的,并且可以较为准确地预测重金属的毒性作用。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：X174
【部分图文】：

形态图,细胞系,胭脂鱼,吻端

组织块边缘第二天就有细胞长出，这些细胞长势迅猛但轮廓不太清晰，可能是粘液细胞，几天后发现这些慢慢死掉。在这些细胞死掉之后从组织块下面长出的细胞形态健康，轮廓清晰，经过3一4天就可以形成有规模的细胞克隆(图2一l)，再经过5一6天就能在组织块之间形成细胞单层，这时就可以用TVS消化进行第一次传代培养。三种组织的原代培养表现出相似的生长模式，先是长出上皮样细胞，慢慢再长出成纤维状细胞。原代细胞经TVS分次消化2一5而n后，大多数细胞边缘卷起，脱离瓶壁变圆，收集细胞后接种于新的培养瓶中进行传代培养，细胞在24h后基本能贴壁。视初次传代接种的细胞密度，细胞5一8天接近长满瓶壁，倒置显微镜下观察，细胞分别呈长梭形(CSM、CSSN)和短梭形(RMF)。经过3一5次传代后，细胞逐渐长成整齐的成纤维状细胞(图2一2)。细胞在传代8次以后，就能在25℃或室温下很容易保持其快速生长。

胭脂鱼,鳍条,吻端,细胞系

图2-2胭脂鱼肌肉细胞系CSM、吻端组织细胞系CSSN和稀有的娜鳍条细胞系R州田的细胞形态观察A，CSM;B，CSSN;C，RMF。放大倍数:SOxFig.2·2Photo而crograPhyofeelllinesCSMandCSSNderivedfromChinesesuckerandRM[Fderivedf比m段代minnowA，CSM:B，CSSN:C，RMEMagnification:SOX3.2细胞的冻存和复苏能力分别对三株新建细胞的5代，ro代和巧代冻存的细胞进行复苏，经细胞计数结果如表2一1所示三株细胞在冻存复苏后的存活率均在90%以上，其细胞贴壁率也在50%一80%之间。复苏后的细胞形态、生长状况与未冻存的细胞基本类似，未见明显区别，冻存时间对其影响也不大。表2-1新建细胞系的冻存复苏能力

序列,染色体形态,细胞系,染色体

图2.6三株细胞系的染色体条数分布及染色体形态。A:CSM;B:CSSN;C.RMF。放大倍数:1以X)xFig.2·6ThefrequencydistributionofehromosomesOfthreenewlyes妞blishedcellstreatedwithcolehieinesandPhase·eontrastPhoto而emgraPhOfthesethreenewes妞blishedeellscellularchromosomesarrestedinme妞Phase.A:CSM:B:CSSN;C.RMEMagnifieation:1000x.3.5线粒体基因分析通过对线粒体基因的分析验证这三株细胞系的种质来源。通过PCR扩增CSM、CSSN基因组中的cytb和125rRNA基因，分别得到503bp和690bp的产物(图2一7，A);通过PCR扩增RMF基因组中的cytb和185rRNA基因，分别得到840bp和107bP的产物(图2一7，B)。经过测序分析，其序列与发表的序列一致。

【引证文献】