基于免疫PCR生物条形码技术检测多氯联苯的研究

发布时间：2020-09-29 15:25

　　多氯联苯(PCBs)是一类人工合成的有机氯化合物,它具有优良的物理化学性质,曾经广泛的应用于工业生产中。虽然PCBs已经被禁止使用了近40年,但仍能在环境的各个角落检测到它的存在。PCBs在环境中难降解,并具有生物蓄积性和高毒性,给生态环境和人类健康带来了巨大的威胁。PCBs也因此成为各个国家和地区重点监测的污染物之一。目前检测PCBs的主要方法为气相色谱法,但该方法对样品前处理要求苛刻,所需仪器价格昂贵,检测成本高,检测周期长,不适合对样品的快速高通量分析检测。而免疫分析方法具有操作简单、成本低、灵敏度高、能够实现对目标分子的快速高通量分析检测等优点,目前已广泛的用于环境污染物的分析检测。因此,建立快速简便的免疫分析方法来检测PCBs具有重要的意义和广阔的应用前景。本文制备了三种分别针对PCB12、PCB37和PCB77的多克隆抗体和一种抗PCB37的单克隆抗体,在此基础上建立了检测PCB12、PCB37、PCB77的间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA);将制备的抗体进行生物素化处理,建立了检测PCBs的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法(BA-ELISA);将不同的抗体和DNA修饰在金纳米颗粒(GNPs)表面,制备了多种抗体-GNPs-DNA探针,用于取代传统免疫PCR中的抗体-DNA结合物,基于这些探针,建立了基于实时荧光定量免疫PCR(rt-IPCR)的生物条形码方法(BCA)来检测环境中的PCBs。将这些方法用于实际环境样品中PCBs的分析检测,取得了满意的结果,为实现快速、高通量分析检测环境中的PCBs提供了可靠的技术支撑。主要研究结果如下:(1)以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白,分别用活化酯法和混合酸酐法制备了三种PCBs单体的人工免疫原和包被原,产物通过紫外光谱扫描分析确定半抗原与蛋白质成功偶联;通过免疫新西兰大白兔,制备了三种分别抗PCB12、抗PCB37和抗PCB77的多克隆抗体,所得的抗体特异性较好,效价较高,均能达到1:256000;本文还通过免疫小鼠,细胞融合,杂交瘤细胞培养,采集腹水,制备了抗PCB37单克隆抗体,和多克隆抗体相比,该抗体对PCB37的特异性更好。(2)利用所获得的抗体,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的ic-elisa方法。优化了抗原抗体浓度,温育时间,封闭液,有机溶剂,盐离子强度,ph值等实验条件,在最佳实验条件下,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的标准曲线;基于多克隆抗体,该方法对这三种pcbs单体的lod分别为0.016μgl-1、0.048μgl-1、0.063μgl-1。基于单克隆抗体,该方法对pcb37的lod为0.027μgl-1;将该方法用于海底沉积物样品中pcbs的分析检测,回收率均在81%-115%的范围内,变异系数(cv)均小于15%。(3)将抗体进行生物素化预处理,利用生物素-亲和素生物系统,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的ba-elisa方法。优化了包被原及生物素化抗体浓度,sa-hrp浓度,抗原抗体反应时间,生物素化抗体与sa-hrp反应时间等实验条件,同时还讨论了有机溶剂浓度,反应介质中ph值及盐离子浓度对实验的影响;在最佳实验条件下,分别建立了检测pcb12、pcb37和pcb77的标准曲线;基于多克隆抗体,该方法检测pcb12、pcb37和pcb77的ic50分别为0.53μgl-1,0.68μgl-1,1.36μgl-1;lod分别为4.5ngl-1、17ngl-1、18ngl-1;基于单克隆抗体,该方法检测pcb37的ic50为0.27μgl-1,lod8ngl-1;将建立的方法用于带鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品中pcb12、pcb37和pcb77的回收率均在81%-113%之间,cv均小于15%。(4)分别用羊抗兔igg、羊抗小鼠igg及dna修饰15nm的gnps,制备了羊抗兔igg-gnps-dna和羊抗小鼠igg-gnps-dna两种gnps探针,用紫外扫描光谱和透射电镜(tem)对其表征,确定抗体和dna修饰在gnps表面。基于这两种gnps探针,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的间接bca方法。该方法将包被原包被在戊二醛预处理过的pcr管上,让其和样品中的目标分子竞争抗体,与包被原结合的抗体保留在pcr管内,然后通过抗体与gnps探针表面的二抗结合,使得部分gnps探针附着在pcr管内,其他gnps探针则通过洗涤去除,在实时荧光定量pcr扩增阶段,条形码dna从gnps探针表面释放到pcr管内,并作为模板dna直接参与pcr扩增,通过测定条形码dna的量来间接检测样品中pcbs的含量。优化了退火温度,引物浓度,抗原抗体浓度,封闭液,gnps探针浓度,抗体与gnps探针反应时间等实验条件;在最佳实验条件下,基于羊抗兔igg-gnps-dna探针和抗pcb12、抗pcb37、抗pcb77、抗aroclor1248四种多克隆抗体,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77、aroclor1248的标准曲线,其检测下限分别为2.63pgl-1,4.35pgl-1,1.72pgl-1,10.20pgl-1。基于羊抗小鼠igg-gnps-dna探针和抗pcb37单克隆抗体,该方法检测pcb37的lod为2.03pgl-1。将建立的方法用于小黄鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品的回收率均在81%-112%之间,cv均小于15%。(5)分别用不同的抗体和dna修饰15nm的gnps,制备了五种gnps探针,抗pcb12抗体-gnps-dna,抗pcb37多抗-gnps-dna,抗pcb37单抗-gnps-dna,抗pcb77抗体-gnps-dna和抗aroclor1248抗体-gnps-dna,分别用紫外扫描光谱和tem对其表征,确保抗体和dna修饰在gnps表面;基于这五种gnps探针,分别建立了检测pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的直接竞争bca方法。该方法将包被原包被在戊二醛预处理过的pcr管上,让其和样品中的目标分子竞争gnps探针上的抗体,一部分gnps通过包被原与抗体的特异性结合附着在pcr管内,其他gnps探针则通过洗涤去除,在实时荧光定量pcr扩增阶段,条形码dna从gnps探针表面释放pcr管内,并作为模板dna直接参与pcr扩增,通过测定条形码dna的量来间接检测样品中pcbs的含量。优化了金纳米探针浓度,封闭液,抗原抗体反应时间,有机溶剂浓度,反应介质中盐离子强度,ph值等条件,并在最佳实验条件下,分别建立了检测不同目标分子的标准曲线。该方法检测pcb12、pcb77、aroclor1248的检测下限分别为4.36pgl-1,9.12pgl-1,2.55pgl-1;基于多克隆抗体和单克隆抗体,该方法检测pcb37的检测下限分别为4.64pgl-1,3.15pgl-1;将建立的方法用于带鱼样品中pcbs的分析检测,加标样品回收率均在81-110%之间,cv均小于15%。总之,本文建立了ic-elisa、ba-elisa、基于rt-ipcr的间接竞争bca和基于rt-ipcr的直接竞争bca四种免疫分析方法来检测环境样品中的pcbs,这四种方法操作简便,快速,稳定性好,灵敏度高,样品检测结果与gc-ecd具有较好的相关性,能够用于实际环境样品中pcbs的快速高通量分析检测,具有较好的实际应用前景。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：X830
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词语
第一章绪论
    1.1 多氯联苯的概述
        1.1.1 多氯联苯的结构及性质
        1.1.2 多氯联苯的来源
        1.1.3 多氯联苯的危害
    1.2 多氯联苯的检测方法
        1.2.1 气相色谱法
        1.2.2 光谱分析方法
        1.2.3 生物分析方法
        1.2.4 免疫分析方法
    1.3 生物条形码技术概述
        1.3.1 生物条形码技术的原理
        1.3.2 条形码DNA
        1.3.3 纳米粒子在生物条形码技术中的应用
        1.3.4 生物条形码技术的发展
        1.3.5 生物条形码技术的应用
    1.4 研究对象
    1.5 研究目的及意义
    1.6 主要研究内容及技术路线
        1.6.1 主要研究内容
        1.6.2 技术路线
第二章三种PCBs单体人工抗原及抗体的制备
    2.1 引言
    2.2 实验仪器及材料
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验试剂及材料
        2.2.3 试剂配制及材料预处理
    2.3 试验方法与步骤
        2.3.1 免疫原的制备
        2.3.2 包被原的制备
        2.3.3 人工抗原的鉴定
        2.3.4 人工抗原蛋白含量的测定
        2.3.5 偶联物结合比的计算
        2.3.6 多克隆抗体的制备
        2.3.7 单克隆抗体的制备
        2.3.8 抗体效价测试
        2.3.9 抗体特异性分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 人工抗原的合成与表征
        2.4.2 人工抗原的蛋白含量及偶联比
        2.4.3 多克隆抗体的制备及表征
        2.4.4 单克隆抗体的制备及表征
        2.4.5 抗体的特异性分析
    2.5 本章小结
第三章 ic-ELISA检测PCBs方法的建立及应用
    3.1 引言
    3.2 实验仪器及材料
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验试剂及材料
        3.2.3 试剂配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 实验条件的优化
        3.3.2 间接竞争ELISA方法的建立
        3.3.3 标准曲线的建立
        3.3.4 交叉反应率分析
        3.3.5 样品预处理及分析检测
        3.3.6 回收率
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 实验条件的优化
        3.4.2 方法的建立
        3.4.3 交叉反应率
        3.4.4 样品分析检测
        3.4.5 回收率
    3.5 本章小结
第四章 BA-ELISA检测PCBs方法的建立及应用
    4.1 引言
    4.2 实验仪器及材料
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验试剂及材料
        4.2.3 试剂配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 生物素化抗体的制备
        4.3.2 BA-ELISA方法的建立
        4.3.3 实验条件的优化
        4.3.4 标准曲线的建立
        4.3.5 样品预处理及分析检测
        4.3.6 回收率
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 实验条件的优化
        4.4.2 BA-ELISA方法的建立
        4.4.3 样品的分析检测
        4.4.4 回收率
    4.5 本章小结
第五章基于rt-IPCR的间接竞争BCA方法检测PCBs
    5.1 引言
    5.2 实验仪器及材料
        5.2.1 实验仪器
        5.2.2 实验试剂及材料
        5.2.3 寡核苷酸
        5.2.4 试剂配制
    5.3 实验方法
        5.3.1 寡核苷酸链及引物的设计
        5.3.2 实时荧光定量PCR扩增体系
        5.3.3 金纳米颗粒的制备及表征
        5.3.4 二抗的预处理
        5.3.5 金纳米颗粒的修饰及表征
        5.3.6 间接竞争生物条形码方法的基本步骤
        5.3.7 实验条件的优化
        5.3.8 标准曲线的建立
        5.3.9 样品预处理及分析检测
        5.3.10 回收率
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 PCR扩增条件的优化
        5.4.2 金纳米颗粒的制备、修饰及表征
        5.4.3 实验条件的优化
        5.4.4 间接竞争生物条形码方法的建立
        5.4.5 样品的分析检测
        5.4.6 回收率
    5.5 本章小结
第六章基于rt-IPCR的直接竞争BCA方法检测PCBs
    6.1 引言
    6.2 实验仪器及材料
        6.2.1 实验仪器
        6.2.2 实验材料
        6.2.3 寡核苷酸
        6.2.4 试剂配制
    6.3 实验方法
        6.3.1 金纳米颗粒的制备及表征
        6.3.2 抗体的预处理
        6.3.3 金纳米颗粒的修饰
        6.3.4 GNPs探针的表征
        6.3.5 直接竞争生物条形码方法的基本步骤
        6.3.6 实验条件的优化
        6.3.7 标准曲线的建立
        6.3.8 样品的预处理及分析检测
        6.3.9 回收率
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 GNPs的修饰及表征
        6.4.2 实验条件的优化
        6.4.3 实验方法的建立
        6.4.4 样品的分析检测
        6.4.5 回收率
    6.5 本章小结
第七章结论与展望
    7.1 结论
    7.2 创新点
    7.3 展望
参考文献
附录 1
致谢
攻读博士学位期间已发表或录用的文章

【参考文献】