AHL合成酶基因的多样性分布及其表达活性对缺氧环境的响应
发布时间：2020-09-30 20:03
以酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为信号分子的群体感应(Quorum sensing,QS)系统在革兰氏阴性细菌中分布最广,也是目前研究最多的QS系统。已有的关于细菌QS的研究大多基于实验室可培养的方法,且主要集中在QS系统对下游基因与菌群生理行为的调控方面。传统可培养方法的局限性加之目前缺乏AHL合成酶基因的通用引物,限制了我们对基于AHL的QS系统在生态环境中分布及多样性的认识。本文首先设计了一对针对土壤中代表性细菌-根瘤菌科(Rhizobiacae)的AHL合成酶基因的通用引物,并将这对引物分别应用于陆生与湿地植物根际微生物群落,发现不同植物根际所处生境对AHL合成酶基因的分布与多样性有很大影响,其中环境因素尤其是O2很可能起着重要的影响作用。缺氧环境在自然界中普遍存在,然而自然环境中O2浓度的变化是如何影响细菌QS系统基因表达和信号分子合成的目前还不清楚。研究缺氧环境下细菌QS系统的变化可以为定向调控细菌下游生理行为,特别是与污染物修复相关的生理活动提供重要的环境因素依据。为了研究缺氧环境对细菌QS系统的影响,本文从获取具有环境修复价值的研究对象出发进行了菌株的筛选,筛选标准是具有芳香烃降解潜力的AHL产生菌,得到如下结论:具有芳香烃降解与AHL合成双重潜力的细菌在系统分类上具有高度多样性,在被调查的688株Proteobacteria中,超过11%的细菌基因组中同时含有环羟化双加氧酶(ringhydroxylatingdioxygenase,RHD)和AHL合成酶基因;利用富集筛选的方法,从海洋、湿地植物根际以及土壤等环境中筛选到10株既能降解菲或芘又能产AHL的细菌,其中6株属于鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales),四株属于根瘤菌目(Rhizobiales),而这两类细菌在基因组搜索法得到的数据中同样也是优势菌群。分别从以上优势菌群Rhizobiacae和Sphingomonads中选取了具有污染修复潜力的代表性菌株Ensifer adhaerens X097 和Novosphingobium pentaromnaicivorans US6-1作为研究对象,详细表征了两株菌的QS系统,并分别以平板生物膜和静置培养方式作为缺氧环境的代表,研究了缺氧环境对两株细菌AHL合成酶基因表达与AHL合成的影响。得到的主要结论有:(1)在X097和US6-1中,两种缺氧环境均促进了 AHL的合成与AHL合成酶基因的表达。(2)在X097中,位于质粒上的ensIl和ensI2基因分别负责合成多种中短链的AHL,而染色体上ensI3负责合成一种长链的C14-HSL;通过SWISS-MODEL预测的AHL合成酶的三级结构中,质粒上的EnsI1和EnsI2的三级结构更相似,说明质粒和染色体上的AHL合成酶在系统进化、产物合成以及蛋白质三级结构三个方面都显示出很大差异;在缺氧环境下,X097合成的AHL信号分子的种类更多,AHL合成酶基因表达量更高,而且质粒上的AHL合成酶基因比染色体上的对缺氧环境的响应更敏感。(3)US6-1基因组中含有一对novI/novR,当分别敲除ovI或novR后,US6-1均不再合成AHL;US6-1静置培养合成的、以及外源添加的AHL都会在生长期后期被US6-1当作碳、氮源利用,说明US6-1兼具AHL合成和淬灭的能力;US6-1在振荡培养条件下不能合成AHL,而在静置培养条件下可以合成多种AHL,其机制在于有氧环境下novI只有很低水平的转录,缺氧环境则促进了novI的转录和表达,而novR的表达在两种环境下没有显著性差异;(4)探究了两类 O2 响应因子 fnr(fumarate nitrate regulator)和hk(histidine kinase)基因敲除对US6-1合成A1HL的影响,发现缺氧环境下单个fnr的敲除对AHL合成基本无影响,同时敲除任意两个fnr均会提高AHL的产量,同时敲除三个fnr减慢了 AHL的降解速率。位于质粒上的hk3的敲除对AHL合成的影响很小,染色体上的hk1或hk2的敲除虽使AHL的合成提前却降低了 AHL的产量,基因敲除实验的结果共同表明,多个氧气响应因子介导了菌株US6-1的QS系统对缺氧环境的响应;(5)根据转录组测序数据预测到脂肪酸合成途径中的两个关键基因fabZ和fabK在缺氧环境下可能会影响US6-1合成AHL;缺氧环境下由于novI基因表达量的变化会导致很多下游基因的表达量出现显著性变化,包括一系列与环境应激相关的基因,如金属铜和亚碲酸盐矿物耐受基因,以及可能参与PAHs、苯甲酸、氨基苯甲酸酯,阿特拉津等降解代谢的基因等。(6)比较了静置培养条件下菌株US6-1与novI缺失突变株的菲降解率,发现缺氧胁迫下AHL合成酶基因的缺失显著性降低了菌株US6-1对菲的降解率。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172
【部分图文】：
ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅｌａｃｔｏｎｅ，ＡＨＬ）作为信号分子，这类信号分子可以自由的透过细胞膜逡逑分泌到胞外；第二，ＡＨＬ可以被存在于内膜或细胞质中的特定受体蛋白（ＬｕｘＲ）逡逑所识别（图１．１）；第三，Ｇ－细菌的ＱＳ系统一般可以调控支撑各种生物学过程的逡逑数十到上百个基因的表达；第四，ＡＨＬ的合成存在反馈机制，即ＡＨＬ的受体蛋逡逑白结合ＡＨＬ分子后会促进ＡＨＬ合成酶基因的表达，从而促进ＡＨＬ信号分子源逡逑源不断的分泌与积累。逡逑0邋0邋Ｏ邋０逡逑ＡＨＬ邋0逦ＡＨＬ邋0逦0逡逑0逦°邋0邋°邋Ｏ邋Ｏ逡逑ｒ￣＼逦ｎ邋0邋＾逦＾逡逑0邋＾邋0邋0逡逑个逦ＬｕｘＲ逦ｆ逦0逡逑？邋ｗ邋ｐ逦d盛狻蝈义希戾澹蹋眨兀戾危裕幔樱睿澹叔尾坟义希蹋铮麇澹穑铮穑酰欤幔簦椋铮铄澹洌澹睿螅椋簦澹蒎危龋椋纾桢澹穑铮穑酰欤幔簦椋铮铄澹洌澹睿螅椋簦义贤迹保备锢际弦跣韵妇粒龋绦藕欧肿咏榈嫉模眩酉低常郏病藉义希疲椋珏澹保卞澹粒龋体澹恚澹洌椋幔簦澹溴澹眩渝澹螅螅
本文编号：2831319
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172
【部分图文】：
ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅｌａｃｔｏｎｅ，ＡＨＬ）作为信号分子，这类信号分子可以自由的透过细胞膜逡逑分泌到胞外；第二，ＡＨＬ可以被存在于内膜或细胞质中的特定受体蛋白（ＬｕｘＲ）逡逑所识别（图１．１）；第三，Ｇ－细菌的ＱＳ系统一般可以调控支撑各种生物学过程的逡逑数十到上百个基因的表达；第四，ＡＨＬ的合成存在反馈机制，即ＡＨＬ的受体蛋逡逑白结合ＡＨＬ分子后会促进ＡＨＬ合成酶基因的表达，从而促进ＡＨＬ信号分子源逡逑源不断的分泌与积累。逡逑0邋0邋Ｏ邋０逡逑ＡＨＬ邋0逦ＡＨＬ邋0逦0逡逑0逦°邋0邋°邋Ｏ邋Ｏ逡逑ｒ￣＼逦ｎ邋0邋＾逦＾逡逑0邋＾邋0邋0逡逑个逦ＬｕｘＲ逦ｆ逦0逡逑？邋ｗ邋ｐ逦d盛狻蝈义希戾澹蹋眨兀戾危裕幔樱睿澹叔尾坟义希蹋铮麇澹穑铮穑酰欤幔簦椋铮铄澹洌澹睿螅椋簦澹蒎危龋椋纾桢澹穑铮穑酰欤幔簦椋铮铄澹洌澹睿螅椋簦义贤迹保备锢际弦跣韵妇粒龋绦藕欧肿咏榈嫉模眩酉低常郏病藉义希疲椋珏澹保卞澹粒龋体澹恚澹洌椋幔簦澹溴澹眩渝澹螅螅
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