胶质芽孢杆菌多糖型絮凝剂的发酵优化、分离、理化特性及其应用研究

发布时间：2020-10-09 00:03

　　絮凝是一种除去工业废水中污染物很好的方法，而新型絮凝剂的开发与应用是国内外研究的热点。微生物多糖型絮凝剂（polysaccharide-based bioflocculants, PSBs）因具有无毒、可降解等优良特性被认为具有广阔应用前景，但大多数微生物PSB因产量低、活性低、应用范围窄等问题限制了其广泛应用。本研究优化了胶质芽孢杆菌发酵PSB条件，建立了高效分离发酵液PSB的工艺，并纯化得到一种在pH3-9范围内都具有很高活性的絮凝剂PSB1-1。（1）优化胶质芽孢杆菌发酵PSB条件。分别通过单因素和中心组合设计实验（CCD）优化了金属离子对PSB产量和活性。在单因素实验中，与基础培养基相比，MgSO4(0.144g/L)、CaCl2(0.055g/L)、FeCl3(3.25mg/L)分别使PSB产量提高了179%、44%、109%。但中心组合设计实验结果表明，当三种离子共存于培养基时，Mg2+(P=0.0021)对PSB产量的影响是正向的，Ca2+(P=0.0093)对PSB产量是负调节的，Fe3+(P=0.9883)对PSB产量影响不显著。发酵罐分批发酵生产PSB结果表明，通过添加少量特定的复合金属离子（0.144g/L MgSO4、0.028g/LCaCl2和1.625mg/LFeCl3），不仅可以缩短发酵周期12h，还能使PSB产量和碳源转化率分别提高218%和111%，另外絮凝活性也提高27%。与传统的的碳、氮源优化相比，添加少量金属离子是一种更为高效、经济的提高PSB产量和活性的方法。通过进一步的发酵优化，分别确定胶质芽孢杆菌发酵PSB的最适温度和最适pH值分别为28℃和8，最佳培养基为蔗糖139g/L、Na2HPO43.05g/L、MgSO40.167g/L，最大PSB产量为3.034g/L，与金属离子补给培养基相比，PSB产量又提高了127%。（2）胶质芽孢杆菌PSB的分离与纯化。筛选出萃取发酵液PSB的最佳双水相体系组成（乙醇和Na2CO3）。当乙醇浓度为15%，Na2CO3浓度为20%时，PSB选择分配系数β值达到最大值，而分配系数K值也达到最小值，因而确定为萃取PSB的最佳浓度，在此条件下PSB和细胞的回收率均达到98%以上，不仅达到了工业化应用的较高标准，而且为连续萃取发酵提供了可行性依据。将金属离子补给培养基萃取的crude P1和基础培养基萃取的crude P2通过DEAE-52离子交换柱纯化，分别得到PSB1、PSB2和PSB3三种组分。在crude P1中，PSB1和PSB2的含量分别是其在crude P2中3.7倍和5.0倍，而PSB3的含量稍稍高一点，表明添加复合金属离子改变了PSB的组成。最后将PSB1、PSB2和PSB3分别通过Sephadex-200凝胶柱作进一步纯化，分别得到PSB1-1、PSB2-1和PSB3-1三种纯化组分。（3）PSB组分的化学组成与结构测定。凝胶色谱法结果显示PSB1-1、PSB2-1和PSB3-1的平均分子量分别为2.53×106、7.77×106和13.2×106Da。单糖组成分析发现，PSB1-1主要是由果糖、半乳糖、山梨糖、葡萄糖、鼠李糖组成，摩尔比为1:1.08:2.45:1.66:2.78，而PSB2-1、PSB3-1都是由甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖、葡萄糖和木糖组成，摩尔比分别为1:1.16:1.12:2.4:1.72:2.88和1:1.23:1.07:3.3:1.7:3.8。红外图谱分析表明，与PSB2-1和PSB3-1红外光谱相比，PSB1-1在3286cm-1处的吸收峰（与羟基有关）的波数向波数增大的方向平移。PSB1-1的红外光谱在1729cm-1处的吸收峰（与酯键有关）强度大于PSB3-1，而PSB2-1在此处没有吸收峰。PSB1-1在1257cm-1处的吸收峰（与磷酸基团有关）强度大于PSB2-1和PSB3-1。扫描电镜结果表明，与PSB2-1和PSB3-1线性结构相比，PSB1-1线性比较规则，类似树枝状。（4）多糖型絮凝剂应用研究。当絮凝剂浓度为2mg/L时，PSB1-1的絮凝效果最好，絮凝率为98.4%，高于PSB2-1和PSB3-1的絮凝率。PSB1-1在pH3～9的范围内都具有很高的絮凝活性（97%以上），PSB3-1在pH3～6絮凝效果最好，絮凝率在93%～98%之间。而PSB2-1仅在pH3～4范围絮凝率超过90%。依据前述的PSB纯化组分理化性质及结构分析结果，我们推测PSB1-1中羟基、磷酸基团、酯键等功能团含量的提高以及规则的线性结构可能是其絮凝表现优于PSB2-1和PSB3-1的主要原因。PSB1-1的热稳定性很好，在50～100℃加热30min后絮凝率仍保持在96～98%之间。三价离子（Al3+和Fe3+）和二价离子（Ca2+、Mg2+和Fe2+）比一价离子（Na+和K+）更有利于促进PSB1-1的絮凝效果。当高岭土浓度超过10g/L时，PSB1-1絮凝率低于80%。PSB1-1对生物制品厂工业废水（pH7.11）处理效果优于工业上应用的絮凝剂PAM和PAC，即当PSB1-1的浓度为1mg/L时，COD和SS的去除率分别为91.1%和97.5%。对造纸废水（pH8.57）的处理效果虽然不及PAM，但仍优于PAC，即当PSB1-1的浓度为3mg/L时，COD和SS的去除率分别为81.3%和和93.6%。对垃圾渗滤液（pH6.08）的处理效果虽不如处理生物制品厂和造纸废水，但同等条件下，PSB1-1处理废水效果要优于PAM和PAC，即当PSB1-1的浓度为6mg/L时，COD和SS的去除率分别为66.2%和80.1%。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：X172;X703
【部分图文】：

菌落形态,革兰氏染色

第一章绪论细菌，而本研究中的胶质芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）属于硅酸盐细菌，它最早是由苏联学者 Bassalik 于 1912 年从蚯蚓肠道中分离出来的，但直到 1950 年人们才把这株菌命名为胶质芽孢杆菌。本研究中胶质芽孢杆菌平板菌落形态以及显微镜下菌体形态如图 1-1 所示，胶质芽孢杆菌 GIM1.16 在无氮培养上形成无色、透明、如半玻璃珠状的菌落形态，由于粘性大，用接种环挑起菌落时可拉成丝。革兰氏染色呈阴性，菌体呈杆状，末端为圆形，大小为(0.9～1.8)×(3.1～7.2μm)。

产碱杆菌,结冷胶,单胞菌,路径

第一章绪论催化的一个反应步骤代表着一个碳水化合物代谢的分支点，将葡萄糖-6-磷酸可逆转变成葡萄糖-1-磷酸，就分解代谢路径来说，葡萄糖-6-磷酸进入分解代谢产生能量和还原力；就合成代谢路径来说，产生的葡萄糖-1-磷酸又是糖核苷酸的前体。又如脱氧胸苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（TGP）是多糖合成前体物质 dTDP-L-鼠李糖合成的关键酶[51]。

节杆菌,絮凝剂,保纯,方法

还可减少感染杂菌的。接种量过大，会导致发酵体系量太小，会延长发酵周期，降低与纯化剂是菌在生长过程中代谢产生但并不是所有的成分都具有絮凝0]。另外，这些微生物絮凝剂一而分解变质，影响絮凝剂的保纯化，以便延长保质时间和提

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