微生物降解四环素特性及降解机理研究

发布时间：2020-10-13 00:31

　　 四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素,其价格低廉,抗菌谱广,是目前世界上使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一。由于其用量大,吸收少,大部分以原药形式排出,容易在环境中积累。环境中残留的四环素类抗生素严重影响土壤生态环境和植物生长,对人类健康构成潜在危害。快速有效的清除环境中的抗生素残留已成为目前研究的热点。虽然先前的研究中有许多四环素非生物降解的报道,但环境中微生物降解四环素及降解过程却鲜为人知。此外,对于微生物在不同营养条件下抵抗并转化四环素的分子机制尚不清晰。因此,筛选四环素降解特种微生物并弄清其降解机理,可为实际应用提供四环素污染的土壤和水体的生物修复及环境治理技术的研发提供理论依据,也为更多的抗生素的降解机理研究提供方法借鉴,具有较大的理论意义和潜在的应用价值。本研究以四环素污染土壤为研究对象,分离筛选出四环素高效降解微生物;通过对微生物降解四环素特性的研究,建立微生物降解四环素的动力学模型;利用液相色谱串联质谱仪捕捉四环素的微生物降解产物并推测降解途径;分析降解菌株的基因组学和蛋白质组学特性提出微生物抵抗并降解四环素的分子机制。论文主要研究结果如下:从长期污染四环素的土壤中分离筛选出一株四环素高效降解菌DT1,该菌株不能以四环素作为唯一碳源,但可以在外源营养存在的条件下降解四环素。通过形态、生理生化特性和16S rRNA同源性分析,鉴定菌株DT1为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。通过研究DT1的生长条件表明:DT1为中温菌,最适生长温度为30oC,偏爱中性偏碱的环境(pH为7-10),而在酸性环境中生长显著抑制,较少的装液量(25-50 mL/250 m L)能为细菌生长提供更充足的氧气,促进其生长繁殖。通过研究接种量、装液量、培养温度、初始pH等因素对DT1降解四环素的影响,探讨微生物降解四环素的特性,结果表明:接种量对四环素的降解没有显著影响,当初始pH为9,温度为30oC,装液量为50 mL/250 m L时,四环素的降解率达到最大95%。通过对四环素降解过程的动力学拟合及推导,得到DT1降解四环素的动力学模型。通过对不同初始四环素浓度与初始生物降解速率的拟合,发现Michaelis-Menten模型能够很好的描述,经计算v_(max)和K_m值分别为62.14 mg L~(-1)d~(-1)和80.52 mg L~(-1)。利用抑菌圈法研究了四环素微生物降解产物的抑菌效果,结果表明四环素生物降解和水解产物对大肠杆菌的抑制都减弱。采用液相色谱质谱联用法对四环素的水解及生物降解产物进行了分析鉴定,共捕捉到2种水解产物ETC及ISO-TC,6种四环素微生物降解产物,分别为TP 431、TP 415、TP 387、TP 370、ISO-TP 415、ISO-TP 387。通过降解产物的分析,提出了四环素经微生物脱甲基、脱氢、脱羰基和脱氨基作用的酶催化代谢途径。采用Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台,绘制了四环素降解菌株DT1的全基因组草图。全基因组总长度为4.66 Mbp,平均长度为1124.14 bp,由41个scaffold组装成。含有4146个基因,tRNA 71个,rRNA 10个,其它非编码RNA 43个,GC含量为66.48%,预测的开放式阅读框(ORFs)数为4052个,编码蛋白为2787个,假蛋白为1153个。通过对基因组的生物信息学分析表明,该菌株有多种功能基因参与抗生素和异源物质代谢及抗性。57个与抗生素抗性相关的基因,包括40种多重外排泵和β内酰胺酶;12种重金属阳离子外排泵及若干金属离子抗性蛋白、金属氧化酶和一些调节蛋白等共同造就其重金属抗性;21种加氧酶基因(单加氧酶、双加氧酶和其它加氧酶)可能参与异型物质的代谢。8种不同的过氧化物酶参与细胞的解毒。将DT1基因组同其它三种无四环素降解能力的同种菌株进行基因组比较,发现大部分基因组序列是保守的,但也有小部分区域为DT1所特有,这部分基因可能与DT1的独有特性相关。通过蛋白质组学分析,并结合基因组和降解途径结论,提出了四环素微生物降解的分子机理。7种蛋白质参与了微生物细胞的自我修复解毒过程,6种酶可能直接的参与了微生物对四环素的降解:结瘤蛋白将四环素泵出细胞;HXGPT酶促进核糖体保护蛋白活性;核糖体保护蛋白延长因子Tu和G阻止四环素连接于核糖体的30s亚基上;超氧化物歧化酶和过氧化物酶的联合催化,将四环素4号位的氮甲基进行脱离。通过比较不同营养条件下微生物降解速率关系和蛋白质表达倍数差异,揭示了外源营养影响微生物对四环素降解的机理。结果表明,不同营养条件下超氧化物歧化酶上调表达的趋势同四环素微生物降解趋势相吻合,提出超氧化物歧化酶为控制四环素降解的限速酶。在饥饿条件下,降解菌与四环素抗性和降解相关的蛋白表达均在减弱,细胞仅通过消耗内源性营养物质糖原来维持细胞的生存,并保持细胞外膜的完整以抵抗外界的压力,因此不能进行四环素的降解。本研究系统的研究了四环素降解菌株降解四环素的动力学特性,构建了微生物降解四环素的动力学模型;提出了四环素经微生物脱甲基、脱氢、脱羰基和脱氨基作用的酶催化代谢途径。基于现有的报道,结合本研究的结论,提出了微生物降解四环素的分子机理,丰富了微生物降解四环素的分子机制。
【学位单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X53;X172
【部分图文】：

第一章 绪论1.1 四环类抗生素概况.1.1 四环素类抗生素的性质与特点四环素类抗生素是由链霉菌产生的一类广谱抗生素[1-3]，包括四环素、金霉素、霉素等。它通过同细菌核糖体 30s 亚基上的酰胺-tRNA 结合位点 A 结合，抑制菌蛋白质的合成[4]，从而抑制细菌的生长繁殖。四环素类抗生素的基本结构由氢四并苯环母核及 A 至 D 环上不同的功能基团组成。其中 A-B 环间的 C4a、C12a的立体结构，C4 位的氮二甲基，C3 位酚羟基，C2 位的酰胺基，，C11、C12、12a、C1 的烯酮结构都决定了四环素类抗生素抗菌活性的基本药效。四环素分子构与活性的关系见图 1.1[5]。这些基团决定了四环素类抗生素的紫外特征光谱，且能与许多金属阳离子发生螯合反应形成不同颜色的金属四环素螯合物[6]。

图 1.2 本研究技术路线图1.3.4 创新点本研究的主要创新点主要包含以下两个方面：（1）筛选出对四环素高效降解的菌株 Stenotrophomonas maltophilia DT1，并系统的研究了 DT1 降解四环素的降解特性。（2）揭示了 DT1 中过氧化物还原酶对四环素脱氮甲基的机理，提出了 DT1 降解四环素的途径。

图 2.1 四环素降解菌 DT1 平板及显微照片。四环素降解菌株的生理生化特征T1 的主要生理生化特征见表 2.1。从表中我们可以看出 DT1 接触酶、氧MR 阳性，可以还原硝酸盐、水解明胶、能在 0-5% NaCl 中生长，VP产生、淀粉水解呈阴性。表 2.1 四环素降解菌株 DT1 的生理生化特征项目 结果 项目 结果接触酶 + 脲酶 +氧化酶 + 明胶 +淀粉水解 - NaCl 2% +H2S - NaCl 5% +硝酸盐还原 + NaCl 7% -
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本文编号：2838495