镉污染土壤和作物中镉的生物有效性和毒性的体外细胞检测法对人体健康和环境风险的评估
发布时间：2020-10-18 03:06
镉污染的土壤以及生长在其上的作物给环境和人类健康造成了长期的潜在的威胁。因此了解和掌握通过土壤和食物途径摄入人体中的镉的生物可接受率,生物有效性和毒性是非常必要的。本研究的目的是利用两种不同的土壤和生长在其上的两种作物,建Caco-2细胞/HL-7702胞模型来评价镉的生物有效性/毒性。通过土壤和作物的体外消化结合Caco-2/HL7702细胞模型来进行试验。通过两种土壤(黄壤,石灰性土壤)中及其上生长的作物(水稻,大白菜)中的镉可以引起人肝细胞(HL7702)产生毒害,我们确定了两种土壤中及两种作物中镉的最低浓度。主要结果如下：一、本研究中,人肠癌细胞株Caco2和人正常肝细胞株HL7702分别用来进行镉的生物有效性和毒性试验,并证实这两株细胞可以作为体外细胞模型研究镉在人体肠和肝中的积累和毒性作用。结果表明,镉的吸收在两株细胞中是以剂量依赖的方式增加的,并且在浓度为10 mgL-1时,它在Caco-2细胞中的吸收(720.15μgmg-1 cell protein)显著的高于HL-7702细胞的(229.01 μgmg-1 cell protein) 。同时对两株细胞进行了时间-依赖和剂量-依赖的镉的细胞毒性的检测(LDH释放和MTT试验)。HL-7702细胞抗氧化酶和分化标记物(SOD, GPX和AKP)的活性均高于Caco-2细胞的,尽管随着镉浓度的增加,这些酶的活性均是显著下降的。结果表明,在超过了一定的镉水平下,镉抑制了体外细胞抗氧化酶的活性,并且HL-7702细胞对镉比Caco-2细胞更敏感。然而镉浓度小于0.5 mg L1时对两株细胞没有影响。二、污染的土壤被摄入同样是镉进入人体的一个重要途径,尤其是当儿童不小心通过抓食进入口中。本研究通过体外消化法结合Caco2/HL7702细胞模型,模拟进行了摄取的土壤中的镉在人体中的生物可接受率,生物有效性和毒性试验。结果表明,镉的生物可接受率在胃期(44.3 to89.8%)和在肠期(35.69 to 46.15%)是摄入的黄壤土的大于石灰性土壤的,相应的数值分别为8.65%到56.81%和6.08%到27.30%。镉的生物有效性同样也是摄入的黄壤土(13.50-35.40%)的大于石灰性土壤的(3.5-10.76%)。毒性试验发现,当镉浓度大于0.78μg时,进入人肝细胞的镉会诱导产生氧化胁迫并降低了肝细胞HL-7702中的抗氧化酶的活性。这些结果表明黄壤土镉的摄入污染要大于石灰性土壤的。三、镉由污染的土壤经食物链污染谷物和蔬菜并危害人体健康,因此了解通过稻米途径摄入人体中的镉的生物可接受率,生物有效性和毒性是非常必要的。本研究利用体外消化法结合Caco2/HL7702细胞模型检测镉污染土壤上的稻米,评估了镉在人体中的生物可接受率,生物有效性和毒性。发现镉的生物可接受率(18.45-30.41%)和生物有效性(4.048.62%)在黄壤上生长的稻米显著的高于在石灰性土壤上生长的,对应的数值分别是6.89-11.43%和1.77-2.25%。毒性试验表明加入6 mg kg-1镉在黄壤中稻米便开始产生体外细胞毒害而在石灰性土壤上的稻米则没有显著的变化则是由于稻米中镉的浓度较低。在酸性镉污染的土壤中的作物更利于人体对镉的摄入。因此,监测稻米中镉的浓度来最大程度的减轻对人体健康的危害是必要的。四、采用体外消化结合Caco2/HL7702细胞模型,利用生长在镉污染土壤上的大白菜对人肝细胞产生毒性,进行了镉的最小吸收浓度的试验。结果表明,镉的生物可接受率在胃期生长在黄壤上的白菜(40.84%)和生长在石灰性土壤上的白菜(21.54%)显著高于肠期的,相对应的数值为21.2%和11.11%。Caco2细胞镉的生物有效性是黄壤上的白菜(5.27%-14.66%)的高于石灰性土壤上的白菜(1.12%-9.64%)。此毒性试验中一个重要的发现便是在黄壤和石灰性土壤上转移到白菜中的镉可以通过抑制抗氧化物酶(SOD, GPx)的活性,诱导HL-7702细胞中产生过氧化(MDA, H2O2)胁迫本研究揭示了生长在酸性土壤中(黄壤)的大白菜中的镉削弱了HL-7702细胞抗氧化防御系统在土壤镉浓度为2,6,9 mg kg-1时,从而最终加剧了肝细胞的氧化胁迫,然而,对于石灰性土壤上的大白菜,氧化胁迫只发生在土壤镉浓度为9mgkg1时。酸性镉污染的土壤上生产的蔬菜可以成为人类镉摄入的潜在毒害。因此,有必监测镉在叶菜类蔬菜中的浓度最大限度的减轻对人类的危害。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X833;X820.4
【文章目录】：
ACKNOWLEDGEMENTS
CONTENTS
LIST OF TABLES
LIST OF FIGURES
ABBREVIATIONS
ABSTRACT
摘要
CHAPTER 1 General Introduction and Review of Literature
1.1 Cadmium in soil
1.2 Cadmium in food
1.3 Dietary intake of cadmium by human
1.4 Bioaccessibility and bioavailability of Cd to human
1.4.1 Small intestinal absorption of Cd
1.4.2 Distribution of cadmium after absorption
1.5 Cadmium induced toxicity in human liver
1.5.1 Cellular defense systems and thiol status
1.5.2 Enhancement of lipid peroxidation
1.5.3 Cellular enzymes and cadmium
1.6 Objectives of the study
CHAPTER 2 Impact Assessment of Cadmium Toxicity and its Bioavailability in Human Cell Lines （Caco-2 and HL-7702） 18
2.1 Introduction
2.2 Materials and methods
2.2.1 Chemicals and reagents
2.2.2 Preparation of Cd solutions
2.2.3 Cell culture
2.2.4 Cadmium uptake
2.2.5 Cytotoxicity assays
2.2.5.1 MTT assay
2.2.5.2 LDH （Lactate Dehydrogenase） release
2.2.6 Enzyme assays
2.2.6.1 Glutathione peroxidase （GPx）
2.2.6.2 Superoxide dismutase （SOD）
2.2.6.3 Alkaline phosphatase （AKP）
2.2.7 Protein assay
2.2.8 Statistical analysis
2.3 Results and discussion
2.3.1 Cellular uptake
2.3.2 Effect of cadmium on LDH release and mitochondrial activity （MTT）
2.3.3 Effect of Cd on antioxidant enzymes activity
2.3.4 Effect of Cd on differentiation marker enzyme （AKP）
CHAPTER 3 In Vitro Determination of Cadmium Bioaccessibility and Bioavailability in Contaminated Soils and its Subsequent Toxicity in Normal Human Liver （HL-7702） Cells
3.1 Introduction
3.2 Materials and methods
3.2.1 Chemicals and reagents
3.2.2 Soil collection and analysis
3.2.3 Total Cd of soil samples
3.2.4 Oral bioaccessibility of soil Cd
3.2.5 Cell culture
3.2.6 Cd bioavailability assays by Caco-2 cells
3.2.7 Toxicity assays via normal human liver （HL-7702） cell
3.2.7.1 Cytotoxicity test
2O2） enzymes activities'> 3.2.7.2 Analysis of lipid peroxidation （MDA） and oxidant （H2O2） enzymes activities
3.2.7.3 Measurements of antioxidant （SOD, GPx） enzymes activities
3.2.8 Transmission electron microscopic studies
3.2.9 Quality control of cadmium analysis
3.2.10 Statistical analysis
3.3 Results
3.3.1 Physico-chemical properties of soil
3.3.2 Cadmium bioaccessibility in soils
3.3.3 Cadmium bioavailability in contaminated soils
3.3.4 Cytotoxicity assays
2O2） activity in HL-7702 cells'> 3.3.5 Effect of Cd on lipid peroxidation and hydrogen peroxide （H2O2） activity in HL-7702 cells
3.3.6 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） activities in HL-7702 cells
3.3.7 Ultrastructural changes in HL-7702 cells
3.4 Discussion
CHAPTER 4 Uptake of Cadmium by Rice Grown on Contaminated Coils and its Bioavailability/Toxicity in Human Cell Lines （Caco-2/HL-7702）
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Chemicals and reagents
4.2.2 Glass house experiment, sampling and analysis
4.2.2.1 Soil collection, analysis and Cd spiking
4.2.2.2 Glasshouse experiment
4.2.2.3 Rice sample preparation
4.2.3 Chemical analysis
4.2.3.1 Total Cd in soil and rice grain
4.2.4 Cadmium bioavailability and toxicity assay
4.2.4.1 In vitro digestion of rice sample
4.2.4.2 Cell culture
4.2.4.3 Cadmium uptake experiment in Caco-2 cell
4.2.5 Cadmium toxicity assays in HL-7702 cells
4.2.5.1 Cytotoxicity assay
4.2.5.2 Enzyme assays
4.2.6 Transmission electron microscopy
4.2.7 Quality control of cadmium analysis
4.2.8 Statistical analysis
4.3 Results
4.3.1 Physico-chemical properties of soil
4.3.2 Yields of rice grain
4.3.3 Cd concentration in polished rice grain
4.3.4 Bioaccessibility of Cd in polished rice grain
4.3.5 Cd bioavailability of polished rice
4.3.6 Effect of cadmium on cytotoxicity assays (LDH release and MTT viability assay
4.3.7 Effect of cadmium on lipid peroxidation and enzymes （oxidant+antioxidant） activities in HL-7702 cells
4.3.8 Effect of Cd stress on ultrastructural changes in HL-7702 cells
4.4 Discussion
CHAPTER 5 In vitro Assessment of Cadmium bioavailability in Chinese Cabbage Grown on Different Soils and its Toxic Effects on Human Health
5.1 Introduction
5.2 Materials and methods
5.2.1 Chemicals and reagents
5.2.2 Ethics statement
5.2.3 Soil collection and analysis
5.2.4 Greenhouse experiment
5.2.5 Total Cd of soil and plant
5.2.6 Cadmium bioavailability and toxicity assays
5.2.6.1 In vitro digestion
5.2.6.2 Cell culture
5.2.6.3 Cd uptake （retention and transport） by Caco-2 cells
5.2.7 Cadmium toxicity assays by HL-7702 cells
5.2.8 Cytotoxicity assays
5.2.8.1 MTT assay
5.2.8.2 LDH release
5.2.9 Lipid peroxidation assay
5.2.10 Antioxidant and oxidant enzymes assays
5.2.11 Transmission electron microscopy
5.2.12 Quality control of cadmium analysis
5.2.13 Statistical analysis
5.3 Results
5.3.1 Characteristics of soils
5.3.2 Accumulation of Cd in Chinese cabbage
5.3.3 Bioaccessibility of Cd in Chinese cabbage shoots
5.3.4 Bioavailability of Cd from Chinese cabbage
5.3.5 Cd affected cell viability （MTT） and stability （LDH release） in HL-7702 cells
5.3.6 Cd Induced lipid peroxidation （MDA） in HL-7702 cells
2O2） enzyme activities in HL-702 cells 83'> 5.3.7 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） and oxidant （H2O2） enzyme activities in HL-702 cells 83
5.3.8 Effects of Cd on morphological alterations in HL-7702 cells
5.4 Discussion
CHAPTER 6 Conclusions and Future Recommendations
6.1 Main conclusions
6.2 Future perspectives
REFERENCES
LIST OF PUBLICATIONS
【相似文献】
本文编号：2845710
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X833;X820.4
【文章目录】：
ACKNOWLEDGEMENTS
CONTENTS
LIST OF TABLES
LIST OF FIGURES
ABBREVIATIONS
ABSTRACT
摘要
CHAPTER 1 General Introduction and Review of Literature
1.1 Cadmium in soil
1.2 Cadmium in food
1.3 Dietary intake of cadmium by human
1.4 Bioaccessibility and bioavailability of Cd to human
1.4.1 Small intestinal absorption of Cd
1.4.2 Distribution of cadmium after absorption
1.5 Cadmium induced toxicity in human liver
1.5.1 Cellular defense systems and thiol status
1.5.2 Enhancement of lipid peroxidation
1.5.3 Cellular enzymes and cadmium
1.6 Objectives of the study
CHAPTER 2 Impact Assessment of Cadmium Toxicity and its Bioavailability in Human Cell Lines （Caco-2 and HL-7702） 18
2.1 Introduction
2.2 Materials and methods
2.2.1 Chemicals and reagents
2.2.2 Preparation of Cd solutions
2.2.3 Cell culture
2.2.4 Cadmium uptake
2.2.5 Cytotoxicity assays
2.2.5.1 MTT assay
2.2.5.2 LDH （Lactate Dehydrogenase） release
2.2.6 Enzyme assays
2.2.6.1 Glutathione peroxidase （GPx）
2.2.6.2 Superoxide dismutase （SOD）
2.2.6.3 Alkaline phosphatase （AKP）
2.2.7 Protein assay
2.2.8 Statistical analysis
2.3 Results and discussion
2.3.1 Cellular uptake
2.3.2 Effect of cadmium on LDH release and mitochondrial activity （MTT）
2.3.3 Effect of Cd on antioxidant enzymes activity
2.3.4 Effect of Cd on differentiation marker enzyme （AKP）
CHAPTER 3 In Vitro Determination of Cadmium Bioaccessibility and Bioavailability in Contaminated Soils and its Subsequent Toxicity in Normal Human Liver （HL-7702） Cells
3.1 Introduction
3.2 Materials and methods
3.2.1 Chemicals and reagents
3.2.2 Soil collection and analysis
3.2.3 Total Cd of soil samples
3.2.4 Oral bioaccessibility of soil Cd
3.2.5 Cell culture
3.2.6 Cd bioavailability assays by Caco-2 cells
3.2.7 Toxicity assays via normal human liver （HL-7702） cell
3.2.7.1 Cytotoxicity test
2O2） enzymes activities'> 3.2.7.2 Analysis of lipid peroxidation （MDA） and oxidant （H2O2） enzymes activities
3.2.7.3 Measurements of antioxidant （SOD, GPx） enzymes activities
3.2.8 Transmission electron microscopic studies
3.2.9 Quality control of cadmium analysis
3.2.10 Statistical analysis
3.3 Results
3.3.1 Physico-chemical properties of soil
3.3.2 Cadmium bioaccessibility in soils
3.3.3 Cadmium bioavailability in contaminated soils
3.3.4 Cytotoxicity assays
2O2） activity in HL-7702 cells'> 3.3.5 Effect of Cd on lipid peroxidation and hydrogen peroxide （H2O2） activity in HL-7702 cells
3.3.6 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） activities in HL-7702 cells
3.3.7 Ultrastructural changes in HL-7702 cells
3.4 Discussion
CHAPTER 4 Uptake of Cadmium by Rice Grown on Contaminated Coils and its Bioavailability/Toxicity in Human Cell Lines （Caco-2/HL-7702）
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Chemicals and reagents
4.2.2 Glass house experiment, sampling and analysis
4.2.2.1 Soil collection, analysis and Cd spiking
4.2.2.2 Glasshouse experiment
4.2.2.3 Rice sample preparation
4.2.3 Chemical analysis
4.2.3.1 Total Cd in soil and rice grain
4.2.4 Cadmium bioavailability and toxicity assay
4.2.4.1 In vitro digestion of rice sample
4.2.4.2 Cell culture
4.2.4.3 Cadmium uptake experiment in Caco-2 cell
4.2.5 Cadmium toxicity assays in HL-7702 cells
4.2.5.1 Cytotoxicity assay
4.2.5.2 Enzyme assays
4.2.6 Transmission electron microscopy
4.2.7 Quality control of cadmium analysis
4.2.8 Statistical analysis
4.3 Results
4.3.1 Physico-chemical properties of soil
4.3.2 Yields of rice grain
4.3.3 Cd concentration in polished rice grain
4.3.4 Bioaccessibility of Cd in polished rice grain
4.3.5 Cd bioavailability of polished rice
4.3.6 Effect of cadmium on cytotoxicity assays (LDH release and MTT viability assay
4.3.7 Effect of cadmium on lipid peroxidation and enzymes （oxidant+antioxidant） activities in HL-7702 cells
4.3.8 Effect of Cd stress on ultrastructural changes in HL-7702 cells
4.4 Discussion
CHAPTER 5 In vitro Assessment of Cadmium bioavailability in Chinese Cabbage Grown on Different Soils and its Toxic Effects on Human Health
5.1 Introduction
5.2 Materials and methods
5.2.1 Chemicals and reagents
5.2.2 Ethics statement
5.2.3 Soil collection and analysis
5.2.4 Greenhouse experiment
5.2.5 Total Cd of soil and plant
5.2.6 Cadmium bioavailability and toxicity assays
5.2.6.1 In vitro digestion
5.2.6.2 Cell culture
5.2.6.3 Cd uptake （retention and transport） by Caco-2 cells
5.2.7 Cadmium toxicity assays by HL-7702 cells
5.2.8 Cytotoxicity assays
5.2.8.1 MTT assay
5.2.8.2 LDH release
5.2.9 Lipid peroxidation assay
5.2.10 Antioxidant and oxidant enzymes assays
5.2.11 Transmission electron microscopy
5.2.12 Quality control of cadmium analysis
5.2.13 Statistical analysis
5.3 Results
5.3.1 Characteristics of soils
5.3.2 Accumulation of Cd in Chinese cabbage
5.3.3 Bioaccessibility of Cd in Chinese cabbage shoots
5.3.4 Bioavailability of Cd from Chinese cabbage
5.3.5 Cd affected cell viability （MTT） and stability （LDH release） in HL-7702 cells
5.3.6 Cd Induced lipid peroxidation （MDA） in HL-7702 cells
2O2） enzyme activities in HL-702 cells 83'> 5.3.7 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） and oxidant （H2O2） enzyme activities in HL-702 cells 83
5.3.8 Effects of Cd on morphological alterations in HL-7702 cells
5.4 Discussion
CHAPTER 6 Conclusions and Future Recommendations
6.1 Main conclusions
6.2 Future perspectives
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本文编号：2845710
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