基于微流控芯片技术的快速环境免疫分析检测新方法

发布时间：2020-10-21 03:56

【摘要】：随着社会的发展和环境问题日益受到重视,环境科学研究的内涵不断的丰富,对于自然界中环境与生物的相互作用,尤其是环境中各种生物个体与生物相关物质的特点与变化成为环境科学研究的热点之一。在环境科学的各种研究中,对于各种环境因子的分析与测定是进行这些研究工作的基础和前提。在传统的环境分析方法的基础上,随着生物技术手段的丰富与完善,在环境科学的研究中越来越多的利用到生物技术手段进行分析。生物技术分析方法相比传统的物理化学手段,有更高的灵敏性和特异性,但是同样受检测仪器以及反应试剂所限,难以进行真正的快速高效的现场测试。同时生物抗体试剂价格较高,在进行大量测定时,成本很高。因此需要开发一种快速、简易、便携、低成本的检测技术,以满足实际的需要。 在微加工技术成熟与发展过程中,微流控芯片已经开始在传统的化学、生物学领域有了广泛的应用。微流控芯片以小型化微型化的优势,可以缩短反应时间,减少试剂消耗,并可进行自动化和并行处理。大多数芯片内的反应总体系小于1微升,极大的减少了试剂消耗；在微流控芯片中,很多抗原抗体分子结合反应速度或其它生物分子之间的识别结合速度有明显的提高,大多数的抗原和抗体之间的反应可以在30分钟内完成。其它许多种生物技术,也都在微流控芯片上成功实现。 本论文主要通过微流控芯片技术和免疫分析技术,建立并开发水体样本中草甘膦、蛋白质分子和原虫包囊的检测方法；初步建立对空气中细菌富集和检测的方法。从环境水体和空气中农药、生物大分子以及微生物三类检测对象来开发新的环境生物分析方法和检测平台。 草甘膦(Glyphosate, C3H8NO5P)是一种非选择性除草剂,广泛应用于农业、林业和水生杂草控制。在国家最新出台的生活饮用水标准GB5749-2006中,草甘膦的限值为0.9毫克／升。本研究基于酶联免疫吸附试验(ELISA)反应机理,在微流控芯片上开发了一种草甘膦选择性检测方法。本方法可以快速检测草甘膦,最低检出浓度约为0.1ppb。与传统的ELISA试剂盒相比,可以节省3/4的时间,并降低4个数量级的试剂消耗。 蓝氏贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫卵囊是国家最新出台的生活饮用水标准GB5749-2006中新增的检测指标,原虫微生物对人类健康的危害也日益引起人们的重视。本研究同样开发了一种用于检测水体中蓝氏贾第鞭毛虫包囊、隐孢子虫卵囊和阿米巴包囊的免疫方法,同时该方法也可以检测原虫感染患者血清中抗体和其它样本中的原虫蛋白,并有希望开发成为一种快速的原虫检测平台。本方法通过在PDMS微流控芯片内能过微球捕获原虫的包囊或卵囊,然后用原虫特异性抗体进行免疫识别并荧光显色,最后用有CCD配置的荧光显微镜记录反应产生的荧光信号。同时我们也开发了一种阿米巴相关蛋白的临床免疫检测方法,检测结果与常规ELISA结果一致,检测时间从原来的三小时缩减至不到一小时。该方法也有希望应用在其他环境中微生物的快速检测中。 对环境中病原微生物的检测对于人类健康具有重要的意义。高效收集富集空气中的微生物,是进行空气中微生物快速分析的关键和前提。我们开发一套微流控芯片装置,能够快速、高效的实现空气中细菌的富集和检测。并以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为例进行了收集验证与检测,其富集效率可接近100%,与传统沉降法对比,富集速度提升4-5倍,免疫检测装置最低可检出十几个金黄色葡萄球菌。该芯片装置操作简单,价格便宜,效率高,结果好。免疫检测芯片结果与传统涂版计数结果一致。 目前,国家对于环境中农药、生物大分子以及微生物等危害人体健康的污染物质检测方法的可靠性、实用性和稳定性有较迫切的需求。本研究在微流控芯片上实现了对于水体的农药草甘膦、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、隐孢子虫卵囊、阿米巴虫包囊及特异性蛋白的免疫检测；此外,通过微流控芯片对微生物气溶胶进行收集和检测进行了前瞻性的研究工作,这些都是目前环境科学关注的重点,对于维护环境健康、防治环境污染物导致的疾病具有重要的意义。通过以上实验证明,微流控芯片具有快速、灵敏、特异性强、低消耗等特点,是适用于水、空气中环境污染物的快速分析检测的最佳研究方法之一、本研究研发的微流控装置,经过进一步优化开发并与其它检测模块、控制模块整合,有希望实现多种现场环境检测。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X830
【图文】：

论文中所涉及的全部芯片都以PDMS为材料基质软烛刻技术的主要过程如图1-1所示。将图形掩膜，放置到涂有光刻胶并固定化的基底上。曝光后经过显影，留下的图形就作为芯片复制的阳模。然后，将PDMS预聚体倾倒在阳模上，进行供烤使得PDMS预聚体交联固化形成饶铸的图形，从图形的四周切下PDMS芯片并从阳模上剥离起来，此时芯片管道已经在PDMS上形成四槽。最后，在适当的地方打孔形成溶液的进出通道，将带有图形的PDMS基片与另一片平而结合，进行可逆或者不可逆的封接，完成芯片的制作 P5

Curtis D Chin等_开发了一种可以同时快速检测mV和梅毒的微流控芯片，如图1-5，通过简单的操作，阳性样木中所含的抗原或抗体就会与胶体金颗粒等25

图C:芯片效果示意图：共六组芯片，4X6个反应管道硅片模具图案如图2-1所示，绿色反应柱部分和红色陶门部分用SU-8负光刻胶曝光制作。蓝色管道部分用AZ-50XZ正光刻胶制作，再用加热法圆化管道。其中所有管道高度均为25um，管道层管道宽度为200um，阀门层管道宽度为lOOum,绿色免疫反应柱的长度为4mm。此方案制成的微流控芯片有两层管道。其中蓝色和绿色部分组成反应管道，井处一辰；红色部分为气脚控制管道，处于管道层下的另外一层。在实际检测中，向红色_门层管道内注入一定体积的水并保持在15-20 psi压强。由此所形成的芯片阔门有如图2-2的效果。当形成半透半封闭结构后，由进样口灌注一定体积的包被过抗体的微球，此时微球全部积累于半透阀一侧
【参考文献】

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本文编号：2849611