湖泊富营养化和蓝藻水华频繁爆发是当前国内外迫切关注的环境问题,其主要危害之一是微囊藻毒素(Microcystins,MCs)的产生。大量研究表明,MCs不但是典型的肝毒素,还具有明显的生殖毒性,可对鱼类的生长发育产生不利影响。为了系统地评估MCs对鱼类生殖和生长发育的毒性效应,本研究选取模式生物斑马鱼(Danio rerio)作为实验材料,首先在急性毒性实验中研究了腹腔注射MC-LR后斑马鱼卵巢的病理损伤及抗氧化系统响应的时间剂量效应规律;进一步采用生命周期暴露,从生长参数、超微组织病理学损伤、性激素含量及调控通路上关键基因表达水平几方面,系统分析了环境相关剂量下MC-LR对斑马鱼生长、生殖内分泌系统的干扰效应;最后,通过亚慢性暴露实验,从精巢组织学、性激素含量、相关基因和蛋白表达多个层面,全面地评估了MC-LR对成年雄性斑马鱼生殖内分泌系统的毒性影响和干扰作用,并对其雌激素效应潜力及产生机制进行了合理的推断。本研究的开展为全面系统地认识MC-LR的生长和生殖毒性、内分泌干扰效应及评估自然条件下MC-LR雌激素效应风险提供了重要的实验依据。主要结果如下:1.在急性毒性实验中,以雌性斑马鱼为研究对象,腹腔注射50和200μg/kg BW剂量的MC-LR,分别在注射后1、3、12、24、48、168 h后取样,研究结果显示:卵巢病理变化在注射后12 h内呈时间依赖性增长,主要表现为空泡化、细胞间隙扩大和细胞溶解;同时MDA含量显著升高,伴随着抗氧化酶CAT、SOD、GPx活性及基因表达不同程度的增加,表明氧化胁迫在MC-LR引起的生殖毒性中起着重要作用;卵巢中GSH的大量消耗暗示GSH解毒途径可能在MC-LR解毒中发挥着关键作用;168 h后卵巢病理损伤和抗氧化机能的恢复,表明组织中抗氧化防御系统的响应是缓解MC-LR毒性影响的重要机制之一。2.在生命周期实验中,斑马鱼从幼鱼阶段(5 d)开始暴露于0、0.3、3和30μg/L MC-LR 90 d至性成熟。结果表明:环境剂量(大于3μg/L)的MC-LR可导致生长受阻,脑、肝脏病理学损伤,性腺发育迟缓;MC-LR对生长发育的抑制效应可能是通过下调GH/IGF轴上游ghrh、pacap1、gh,以及性腺中ghra、igf3、igf2r(雌鱼和雄鱼)和igf1(仅雄鱼)基因表达造成的,并表现出一定的雌雄差异性;3和30μg/L浓度下,卵巢T含量显著下降,而E2含量仍保持稳定,结合HPGL轴基因表达结果推测,性激素变化可能由于卵巢发育迟缓引发机体负反馈调节,导致脑中上游基因fshβ和lhβ上调发挥补偿效应,促进下游性腺中T向E2的转化增加。进一步研究结果显示,各处理组雌鱼肝脏vtg1基因表达和卵巢中VTG含量均显著降低,表明MC-LR会减少雌性斑马鱼卵巢的卵黄储积,进而影响卵母细胞的成熟及生殖功能。3.在亚慢性实验中,将成年雄性斑马鱼暴露于0、0.3、1、3、10、30μg/L MC-LR30 d。研究发现:MC-LR暴露可引起斑马鱼GSI减小、精巢细胞间隙扩大、成熟精子比例降低;MC-LR还能干扰HPGL轴相关基因表达,造成脑中上游基因(gnrh2、gnrh3、cyp19b、erα、erβ、ar、fshβ和lhβ)普遍出现剂量依赖性下调;精巢中类固醇激素合成基因(star、cyp11a、cyp17、cyp19a和fshr)在3μg/L出现上调,但随着浓度的继续升高而有所回落;精巢中性激素E2和T同样出现非剂量依赖性升高,在10μg/L浓度下达到高峰,该结果暗示MC-LR内分泌干扰效应可能是其雌激素效应和细胞毒性双重特性的体现。此外,3、10和30μg/L MC-LR引起雄性斑马鱼肝脏vtg1基因表达上调,表明长期持续性的MC-LR暴露可能对雄性斑马鱼产生雌激素效应;HPGL轴基因表达和精巢性激素含量的相关性分析表明,精巢中E2和T的含量变化与脑和肝脏中基因表达及肝脏ER蛋白表达变化相关性较低,但与精巢类固醇激素合成相关基因表达显著相关,推测MC-LR的雌激素效应可能是通过干扰类固醇激素的合成,而非ER途径介导的。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X503.225;S917.4
【部分图文】：
图 1-1 MC-LR 的分子结构图Fig. 1-1 Structure of MC-LR然环境中 MC-LR 为中性或者带负电荷，由于极性的作用，它酮等溶剂，其在水中的溶解度大于 1 g/L（Rivasseau et al 1998）
图 1-2 性类固醇激素合成通路及关键基因Fig. 1-2 Synthetic pathway of sex steroid hormones and related key genes如图 1-2 所示，最初，胆固醇在类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）的作用
图 2-1 RNA 提取的部分电泳图Fig.2-1 An electrophoresis figure of RNA extraction RNA，用 PrimeScript RT Reagents 反转录试剂盒（
【参考文献】
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