定点突变构建高效降解DFP的重组有机磷水解酶及其增效机制研究

发布时间：2020-10-27 05:09

　　 有机磷水解酶广泛用于生物降解有机磷农药残留和神经毒剂,对环境污染修复和保障人体健康具有重大意义。磷酸三酯酶OPH和甲基对硫磷水解酶MPH(亦称甲基对硫磷降解酶MPD)的研究较为深入。野生菌OPH和MPD降解有机磷农药或有机磷神经毒剂(如G类毒剂沙林、梭曼或模拟物氟磷酸二异丙酯DFP)活性很低,不能满足快速消毒要求。蛋白质工程构建有机磷神经毒剂高效降解酶和优化酶催化环境是提高磷酸三酯酶水解效率的主要途径,也是当前生物消毒技术的研究热点。P-F键属于难彻底水解的磷酯键,与G类神经毒剂产生生物学毒性有着直接关系。DFP是研究P-F键型有机磷毒剂水解机制的最佳模拟剂。本研究从有机磷农药降解菌中克隆了有机磷降解酶基因mpd和oph,构建了原核表达基因工程菌;定点突变成功构建了高效降解DFP的重组有机磷水解酶(rOPHm和rMPDm),并进一步研究了乙醇胺类介质对该酶的增效机制。主要结果如下:1、以施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriHS-D36和黄杆菌Flavobacterium sp.ATCC 27551 基因组为模板,成功克隆到甲基对硫磷水解酶mpd基因和有机磷水解酶oph基因。oph基因全长1014 bp,编码337个氨基酸;mpd基因全长996 bp,编码331个氨基酸。成功构建了重组质粒pET-oph和pET-mpd,并在E.coli获得高效表达;SDS-PAGE电泳显示重组OPH和MPD分子量分别为37 KDa和36KDa;它们的最佳诱导条件分别为18℃、1.0mMIPTG和37℃、1.0mMIPTG。2、以野生型OPH(PDB:1dpm)和MPD(PDB:1p9e)为模板,对重组OPH和MPD进行同源模建。模型显示OPH和MPD同为同源二聚体,活性空腔均含有双核金属。OPH单体为(α—β)8折叠,双核金属为Zn2+。MPD单体含有一个β-lactamase,双核金属为一个Zn2+和一个Cd2+。酶活性中心的底物结合部位由三个疏水口袋组成:OPH离去基团口袋由W102、F103、F277和Y280组成;MPD离去基团口袋为F119、W179和F196残基构成。分子对接显示F103、L111、S72、A147等氨基酸是OPH催化水解DFP的必需基团,且F103是优化OPH催化功能的关键靶点。突变酶的F103Y和底物DFP(或过渡态)的对接值明显升高;Y103的酚羟基可以和DFP形成氢键,有利于DFP的水解。OPH和MPD的活性部位结构相似,推测相应位置的氨基酸残基也影响MPD的活性。采用反向PCR、重叠延伸PCR等基因工程技术,成功构建了 14种突变酶:6种rOPHm和8种rMPDm。这14种突变酶基因均在E.coli BL21中得到可溶性表达;突变为Tyr的突变体对DFP的水解活性都有不同程度的提高。结合分子建模信息,证明103位点是控制OPH催化活性的关键氨基酸残基;F119、W179和F196对MPD的活性有很大影响。3、亲和色谱分离纯化得到电泳纯重组OPH和MPD,进而分析乙醇胺类、胺类和醇类催化介质对rOPH和rMPD水解DFP/MP的影响。结果显示,乙醇胺类能增效OPH水解DFP,且作用效果三乙醇胺(TEA)二乙醇胺(DEA)乙醇胺(MEA)。增效剂介质中的酶促反应动力学符合米氏方程。TEA增效能力在0-400 mM范围内与增效剂浓度正相关。不同TEA浓度下的酶动力学均符合米氏方程,证明增效剂不改变rOPH和rMPD的米氏酶属性。乙醇胺类增效剂显著提高了DFP酶促水解的动力学参数kcat、Vm和kcat/Km。相比之下,胺类增效能力较弱;醇类没有明显增效作用。氟离子(DFP水解产物)抑制动力学分析证明:抑制剂(1-3mMNaF)降低rOPH与DFP的亲和力(Km升高)和抑制DFP酶促水解(kcat和Vm下降));加入TEA可以部分消除这种产物抑制效应。3 mMNaF导致rOPH活性下降约80%;添加300 mM TEA,rOPH动力学参数Vm和kcat/Km均提高到无抑制剂(对照)水平,分别为106.1 ± 1.1 μMmin-1和36.23 ± 5.07 mM-1 s-s。线性作图证明氟离子为线性混合型抑制剂;在0、100、200和300 mMTEA条件下Ki值分别为3.21、5.17、5.45和7.51 mM,证明TTEA增效动力学机制在于缓解氟离子产物抑制。重组OPH/MPD水解MP/PO的动力学参数Km、kcat、kcat/Km和Vm基本不变,说明乙醇胺对rOPH/rMPD水解MP/PO增效作用不明显,即乙醇胺类介质作用P-O键型的底物水解的效果不大;表明该类增效介质仅对P-F键具有专一性。TEA能够促进rOPHm/rMPDm水解DFP的效率,对突变为Tyr的突变体效果更强,而对突变为Ala的突变体效果很弱。进一步证明乙醇胺增效依赖于OPH/MPD活性中心控制产物释放的氨基酸残基。
【学位单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：X592
【部分图文】：

壯学位论文??ＤＯＣＴＯＲＡＬ?ＤＩＳＳＩ－ＲＴＡＴＩＯＮ??金属由Ｈ２０１和Ｈ２３０稳定（图１．ＳＢ）?［１１９，?１２（）Ｉ。ＯＰＨ催化需要一或两个金属离子，天然酶利用??Ｚｎ２＋，二价金属离子Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、Ｍｎ２＋或Ｎｉ２＋可以取代Ｚｎ２＋参与催化［１１９，１２１］。??图１．５?ＰＴＥ的晶体结构［３］??Ａ：?ＰＴＥ的单体结构；Ｂ：?ＰＴＥ的金属结合部位；Ｃ：?ＰＴＥ的底物结合口袋??Ｆｉｇ．?１．５?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＰＴＥ?（ｐｄｂ．?ｌｄｐｍ）??Ａ：?ＴＩＭ－Ｂａｒｒｅｌ?ｆｏｌｄ?ｏｆ?ＰＴＥ；?Ｂ：?Ｍｅｔａｌ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ＰＴＥ；?Ｃ：?Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｐｏｃｋｅｔｓ?ｏｆ?ＰＴＥ??ＯＰＨ最适底物是对氧磷，而对有机磷神经毒剂活性较弱（表１．３）?［１（）７，１２２，１２３］。酶活性中心??有三个疏水口袋，分别与底物分子的三个取代基作用，影响离去基团释放速率，并决定酶的专??一性。大口袋（Ｈ２５４、Ｈ２５７?和?Ｌ２７１）和小口袋（Ｍ３１７、Ｇ６０、１１０６、Ｌ３０３?和?Ｓ３０８）对于酶??识别底物侧链疏水性和中心磷原子手性十分重要；口袋（Ｗ１３１、Ｆ１３２、Ｆ３０６和Ｙ３０９）则控制??离去基团释放［１＜＞５］。??表１．３?ＯＰＨ对不同ＯＰ化合物的活性比较［１（）７

２００３年，中国科学院武汉病毒所张先恩课题组首次从假单胞菌ｆｔ＾ｆｏＯＴｏ／ｊｏｓ?ｓｐ．?ＷＢＣ－３克??隆表达了?ＭＰＤ，随后在２．４Ａ水平上解析了该酶蛋白的晶体结构［１２４，?１２＼结构生物学证据表明??ＭＰＤ是二聚体蛋白，单体折叠成典型的ｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅ花式ａｐ／ｐａ?（图１．６Ａ），与ＴＩＭ－桶折叠有??明显区别［１２￣。ＭＰＤ单体含有３３１个氨基酸残基，分子量约３５?ｋＤａ。ＭＰＤ和ＰＴＥ的双核金属??中心结构相似，但参与稳定金属离子的氨基酸残基不同［１２４］。值得注意的是，ＭＰＤ活性依赖于??Ｃｄ２＋，Ｘ－射线晶体结构和电子密度解析都证明该酶的双核金属中心由等摩尔Ｚｎ２＋和Ｃｄ２＋组成［１２６，??１２７］??〇??ＭＰＤ双核金属ｏ／ｐ与Ｄ２５５侧链羧基和一个桥接氢氧根配位连接，周围是组氨酸富集区，??分布有?Ｈ２３４、Ｈ１４７、Ｈ１４９、Ｈ１５２、Ｈ３０２?和?Ｄ１５１。ａ?金属由?Ｈ１５２，?Ｈ３０２?和?Ｄ１５１?稳定，呈八??面体结构；Ｐ金属也是八面体结构，由Ｈ１４７、Ｈ１４９、Ｈ２３４和两个桥接配位体稳定（图１．６Ｂ）??［１２８１。ＭＰＤ活性部位和ＰＴＥ有相似结构的疏水口袋．？离去基团口袋由Ｆ１Ｉ９，?Ｗ１７９和Ｆ１９６组??成

博士学位论文??ＤＯＣＴＯＲＡＬ?ＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ??源二聚体组成［１°３’?１３ｅｉ？每个亚基包含球状的Ｎ端结构域和ｐｉｔａ－ｂｒｅａｄ折叠状的Ｃ端结构域（图??１．７Ａ）［１Ｑ３］。双核金属Ｍｎ２＋位于Ｃ端结构域中心，Ａ金属配位连接Ｈ３３６和Ｅ３８１；?Ｂ金属与Ｄ２４４??形成两个配位键；Ｅ４２０和Ｄ２５５参与稳定金属中心（图１．７Ｂ）?［１Ｍ］。ＯＰＡＡ／产物复合物结构显??示金属中心桥接氧原子，据此推测游离酶在水溶剂中存在金属辅因子桥接氢氧根的状态；ＡＭＰＰ??结构的确显示出金属位点同氢氧根形成氧桥［１３１］。ＯＰＡＡ底物结合部位也有三个口袋：大小口袋??和离去基团口袋（图１．７Ｃ）?［１Ｑ３］。小口袋由Ｙ２１２、Ｖ３４２和Ｈ３４３组成；大口袋由Ｌ２２５、Ｈ２２６、??Ｈ３３２和Ｒ４１８组成；它们共同负责结合底物。ＯＰＡＡ离去基团口袋由Ｆ２９２和Ｌ３６６构成，偏爱??体积较小的基团，如氟离子。??
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本文编号：2858092