外源调控下Enterobacterium sp.DNB-S2降解邻苯二甲酸二丁酯的机理研究

发布时间：2020-10-29 18:08

　　 邻苯二甲酸二丁酯(DBP),是塑料工业中广泛使用的增塑剂,DBP具有环境激素效应,其生物毒性强,在环境中难以自然降解。功能微生物在与污染物接触时,其细胞表面发生复杂的物理、化学和生物作用,污染物首先要通过细胞膜进入到细胞内部进而被微生物利用。了解功能菌株在降解DBP过程中细胞界面行为及菌株生长代谢变化对于环境中DBP降解和开发高效修复技术具有重要意义。本研究在长期使用塑料农膜的设施土壤中筛选到一株DBP降解菌DNB-S2,考察外源物质腐殖酸及其模拟物蒽醌-2,6-磺酸钠(AQDS)的添加对于菌株分解去除污染物DBP效能的影响。将DBP降解菌DNB-S2分别在LB培养液,培养液(1)DBP 50 mg·L-1,(2)DBP 50 mg·L-1并添加AQDS100或500 umol·L-1,(3)DBP 50 mg·L-1并添加腐殖酸250或500 mg·L-1。围绕外源调控作用下菌株降解DBP过程中菌体细胞界面反应机制及菌体细胞胁迫响应等涉及的关键科学问题开展研究,考察外源物质添加对于强化降解菌株功能基因表达量的影响,在基因水平上揭示外源调控下微生物降解DBP的分子机理。研究的主要结果如下:降解菌株DNB-S2经16S r DNA鉴定与Gen Bank中核酸数据进行比对分析确定为肠杆菌属(Enterobacterium sp.),Gen Bank获得登录号为KY469198。在72h内可将浓度为50、100、200、500和1000mg·L-1 DBP降解95.46%、93.91%、95.81%、72.31%和70.2%。培养液中加入100 umol·L-1 AQDS和250 mg·L-1腐殖酸能够将菌株在72h内对浓度为500mg·L-1DBP降解率提高至83.12%和84.39%。通过测定不同生长时期菌株胞外聚合物(EPS)中主要成分多糖和蛋白质及所含官能团变化,菌株表面疏水性(CSH)和Zeta电位变化考察菌株DNB-S2与污染物DBP相互作用时菌体细胞界面的变化过程。结果表明,菌株DNB-S2的EPS中含有C-H疏水基团,能够主动捕获环境中DBP。外源AQDS和腐殖酸的加入使菌株EPS中多糖含量升高,蛋白质含量下降,CSH显著升高,但对Zeta电位影响不大。表明外源物质AQDS和腐殖酸通过提高菌株DNB-S2的CSH促进其与疏水性有机污染物DBP靠近和接触,为菌株对DBP进行生物降解奠定了基础。利用流式细胞仪研究不同培养条件下菌株DNB-S2细胞结构和细胞膜的完整性。使用气相色谱质谱仪GC-MS测定菌株DNB-S2细胞膜中脂肪酸的组成及变化情况,通过分析脂肪酸的饱和度研究不同培养条件下菌株细胞膜的流动性。结果表明,DBP可导致DNB-S2细胞的大小和胞内颗粒密度发生不同程改变度的变化,破坏DNB-S2细胞膜的完整性。外源AQDS和腐殖酸的加入减少了培养体系中细胞膜损伤的细胞数量,保护了细胞膜的完整性。GC-MS在菌株DNB-S2细胞膜上共检测到17种脂肪酸。DBP使菌株在生长迟缓期和对数生长期脂肪酸总量出现下降。外源AQDS和腐殖酸可提高菌株中不饱和脂肪酸含量使细胞膜结构变的疏松,增加细胞膜流动性,增加菌株DNB-S2对环境胁迫的适应能力。菌株DNB-S2在不同培养条件下总抗氧化能力T-AOC变化结果表明外源AQDS可以提高菌株DNB-S2的抗氧化水平。DBP降低了菌株对ROS的清除能力,表明DNB-S2虽然能够对DBP进行生物降解但仍然受到DBP的氧化胁迫。外源AQDS对菌株胞内酶清除O2-·能力没有较大影响,但能够提高对·OH和H2O2的清除能力,这将减少H2O2与O2-·反应生成毒性更大的·OH,减少菌株受到毒性更大的·OH自由基产生的氧化胁迫,提高菌株的抗氧化能力。透射电镜观察结果表明DBP能够使部分功能菌出现细胞形状不规则,胞外分泌物减少,细胞质模糊,细胞壁破碎,细胞内物质量减少甚至出现空泡,菌株微观形态改变,外源处理明显改善了菌株超微结构的变化。在菌株对数生长期取样,对4个处理3次生物学重复共计12个样品进行转录组测序,每个样品平均产出1.30 Gb数据,与参考基因组的平均比对率为94.63%。与对照组相比,DBP胁迫处理的菌株出现上调基因10个,下调基因18个。添加外源AQDS处理的菌株出现上调基因53个,下调基因95个。添加外源腐殖酸处理的菌株出现上调基因113个,下调基因300个。将获得差异表达基因进行GO功能分析和KEGG Pathway分析,结果表明DBP使菌株DNB-S2的细胞功能和代谢路径发生改变,特别是细胞膜和细胞膜组成相关基因表达量改变。外源AQDS和腐殖酸通过提高趋化性基因表达量增强了菌株DNB-S2与DBP结合能力。通过提高细胞膜固定组分基因表达量减小DBP通过细胞膜时对细胞膜损伤。通过提高苯酸类物质降解基因增加了DBP中间代谢产物苯酸类物质的降解能力,同时使谷胱甘肽代谢基因正常表达维持菌株抗氧化系统功能的稳定性,进而促使菌株DNB-S2更好的发挥生物功能以应对环境中DBP胁迫提高降解能力。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：

东北农业大学理学博士学位论文环境中 DBP 的至关重要。大量研究表明腐殖酸及其模拟物蒽醌-2,6-磺酸钠（AQDS）可有效促进微生物对优先污染物的降解。然而，利用其促进功能微生物对 PAEs 化合物的降解研究相对较少。本试验以优先控制污染物 DBP 为研究对象，在长期受塑料农膜污染的农业实施土壤中筛选降解菌株，经鉴定后为降解菌为 Enterobacter sp.命名为 DNB-S2。通过外源添加腐殖酸及其模拟物 AQDS，围绕外源调控作用下菌株降解 DBP 过程中菌体细胞界面反应机制及菌体细胞胁迫响应等涉及的关键科学问题开展研究。借助现代分子生物技术中转录组学技术，深入考察外源物质添加对于强化降解菌株功能基因表达量的影响，在基因水平上揭示外源调控下微生物降解 DBP 的分子机理。1.4.2.2 技术路线

图 2-1 37 种脂肪酸标准曲线（20 ppm）Fig.2-1 The standard curve of 37 kinds of fatty acids（20 ppm）2.3.4 细菌酶活性测定2.3.4.1 细胞破碎将培养一定时间的菌悬液以 6000 rpm 常温离心 5 min，弃上清，菌体用灭菌的 PBS 洗涤2 次，随后重悬于 5 mL PBS 缓冲液中，利用超声细胞破碎仪在冰浴条件下进行菌体破壁。超声破壁 10 min（超 3 s，停 3 s）。之后离心（6000 rpm min-1，10 min，4℃），分离弃去细胞壁和细胞碎屑沉淀，上清液为细胞内含物，低温保存。2.3.4.2 蛋白质含量分析本试验中利用考马斯亮蓝 G-250 法进行样品中蛋白质含量分析[119]。2.3.4.3 ATP 酶活性测定本试验根据南京建成生物试剂公司生物试剂盒 A070-6 中方法测定细菌 Ca2+Mg2+-ATP，Na+K+-ATP 和 T-ATP 酶活性。

图 2-2 转录组学分析流程Fig.2-2 Transcriptome analysis process序实验步骤：将不同处理的菌株按 2.2总 RNA，为保证 RNA 质量利用 Nanod0 检测 RNA 完整性。待 RNA 样品合格试剂在 Thermomixer 中适温将 mRNA随机引物合成一链 cDNA，然后然后加，并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修双链 cDNA 进行片段大小选择，最后进nt 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOnePluseqTM 2000 测序仪进行测序。）中含有的少量接头污染及低质量的 Reads、N(不确定碱基)含量比例大于 10ads。控制单个碱基位置的测序错误率的碱基质量值用 Phred quality score 表概率 P，则碱基的 Phred quality score 为
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