孔雀石绿降解菌的分离筛选及其降解基因的克隆与表达

发布时间：2020-10-30 23:41

　　 孔雀石绿(Malachite green),是一种三苯甲烷类染料,在食品.卫生.纺织等工业中普遍使用,自上世纪三十年代以来也作为抗菌剂和杀虫剂广泛应用于水产养殖业。但近年来研究发现,它具有致癌、致畸、致突变即“三致”作用,因此人们开始关注由此引发的环境污染和食品安全问题。在去除这种污染物的多种方法中微生物修复法具有成本低、不会造成二次污染的优势,因此筛选高效降解孔雀石绿的微生物菌株,掌握其降解特性,探索降解的作用机理,具有重要的理论意义和应用价值。本研究的目标是分离、筛选能够在低孔雀石绿浓度环境中降解孔雀石绿的菌株,并对该菌株的分类地位、生物学特性以及在各种环境条件下降解孔雀石绿的特性进行研究,以期为孔雀石绿环境污染的修复工作提供科学依据；同时对其降解酶基因进行克隆和表达,为进一步研究其基因功能、构建具有更强降解能力的基因工程菌奠定基础。采用选择性培养基,从频繁使用孔雀石绿水产育苗池的水样中分离到26株孔雀石绿降解菌,其中MDB-1降解效率最高,经形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列的系统发育分析,鉴定为Pseudomonas stutzeri MDB-1。对以上26株孔雀石绿降解菌16S rDNA序列的系统发育分析表明,孔雀石绿降解菌主要产生于假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobater),产碱杆菌属(Alcaligenes)、微球菌属(Microococcus)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)六个大类。对菌株MDB-1的最适生长条件的研究表明：菌株MDB-1的最适生长温度为30℃；最适初始pH在7左右；装液量小于50mL/250mL时,生长旺盛；NaCl浓度0～3%范围内MDB-1均可生长,最适NaCl浓度为1%。在供试的几种碳源中,MDB-1对淀粉和糊精的利用较好,麦芽糖和葡萄糖次之；在以葡萄糖为碳源同时以有机氮作氮源时,以酵母提取物为最佳,MDB-1对无机氮源利用普遍较差。MDB-1在发酵培养基中生长,0～6h为延滞期,6～12h为对数生长期,12～0 h为稳定期,20 h以后进入衰亡期。对MDB-1降解特性的研究表明：MDB-1能够以孔雀石绿作为唯一碳源进行生长,在48 h内可使10mg-L-1的孔雀石绿完全降解。它同时还能降解结晶紫、碱性品红等三苯甲烷类染料。MDB-1降解孔雀石绿的浓度以50mg-L-1以下为宜,特别是低浓度(1-5mg·L-1)下能够彻底降解孔雀石绿。MDB-1降解孔雀石绿的最适温度为25℃-30℃,最适pH值为8.0～9.0；在250mL三角瓶中装液量以25 mL降解效果最好,接种量以4.5×10！(3%)为宜。添加乳糖、糊精、淀粉、麦芽糖、蔗糖、果糖等碳源以及酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏和(NH4)2SO4等氮源均可提高MDB-1对孔雀石绿的降解。连续添加孔雀石绿MDB-1可反复降解5次以上。根据已报道的三苯甲烷还原酶基因序列设计引物,通过PCR方法从降解菌MDB-1中克隆到了三苯甲烷还原酶基因tmr2,其碱基对数为864 bp,编码288个氨基酸。将MDB-1中tmr2基因序列与GeneBank中同源性较高的4个序列进行比较发现,在基因水平上,5株降解菌的三苯甲烷还原酶基因有9个位点碱基有差异；相互之间的同源性为99%-100%；在氨基酸水平上,5株降解菌的三苯甲烷还原酶有5个位点的氨基酸残基有差异,相互之间的同源性也为99%-100%,根据基因和氨基酸的差异可初步将5株菌分为A、B两种亚型。采用SEFA-PCR的方法从MDB-1中分别克隆到tmr2基因上游1600bp和下游3000bp的碱基序列,通过比对分析,发现tmr2基因下游存在转座酶,而且tmr2基因G+C含量与16S rDNA G+C%含量相差较大,由此初步推测lmr2很有可能在孔雀石绿降解菌之间存在漂移现象。将MDB-1中编码三苯甲烷还原酶的tmr2基因连接到表达质粒载体pET29a上在E coli BL21中实现了基因的超量表达。SDS-PAGE分析表明,tmr2编码的蛋白单个亚基的分子量为30 kd。该蛋白为依赖于辅酶NADH (NADPH)的三苯甲烷还原酶(Tmr2),能够快速降解孔雀石绿和结晶紫。在对表达后纯化的Tmr2酶学性质的研究中,确立了酶学反应体系为：0.1 mol·L-1 PBS (pH7.5) 969μL, 5mg·mL-1 MG 6 μL 5mmol·L-1 NADH 20μL,酶5μL,反应1 min,然后用1μL CH2Cl2中止反应,立即测定OD622。一个酶活力单位(U)定义为：在pH 7.5,温度50℃条件下,每分钟催化转化1μmol·L-1孔雀石绿所需要的酶量。Tmr2最适反应温度为50℃,其热稳定性较好,在60℃以下保持30min,其酶活仍能保持65%以上；最适pH为7.5,在pH5.0～8.0范围内能保持较高的酶活；Ag+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+等13种金属离子中除Ca2+、 Zn2+、Mg2+、Li+随浓度升高作用变化不大外,其它金属离子都随浓度升高而抑制作用增强。将MDB-1中编码三苯甲烷还原酶的tmr2结构基因连接到表达质粒载体pPICZaA上,在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115中得到了表达。表达蛋白主要分泌在上清液中,使酶的制取更为方便。通过对酵母表达条件的优化,获得了摇瓶高密度发酵的最佳条件：以BMGY作为种子培养基,菌体密度OD600达到12时,重悬于1/10体积的BMMY中开始诱导表达,此时菌体密度相当于OD600达到120,甲醇诱导剂量为2.5%,pH值6.0,诱导72 h,表达蛋白的酶活达到最大。在此优化条件下,上清液酶活可达到134.9U,比优化前提高了3.6倍。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：X592;X172
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号与缩略语说明
前言
文献综述 三苯甲烷类染料的生物降解研究进展
    1 三苯甲烷类染料概述
        1.1 三苯甲烷类染料的用途、分类和主要化合物结构
        1.2 三苯甲烷染料对水环境的污染
        1.3 孔雀石绿对水产品的污染和对人类的危害
            1.3.1 孔雀石绿的性质
            1.3.2 孔雀石绿的应用
            1.3.3 孔雀石绿对水生动物的毒性
            1.3.4 孔雀石绿对人和哺乳动物的毒性
        1.4 孔雀石绿及其代谢产物的检测方法
    2 水体中三苯甲烷类染料的去除研究
        2.1 化学和物理方法
        2.2 生物技术方法
            2.2.1 分离筛选高效降解微生物
            2.2.2 优化外界环境因素
            2.2.3 共代谢降解
    3 三苯甲烷类染料生物降解的机理研究
        3.1 降解途径
        3.2 微生物降解三苯甲烷类染料的酶学研究
        3.3 微生物降解三苯甲烷类染料的基因克隆和表达研究
    4 微生物降解三苯甲烷类染料研究的前景与展望
    参考文献
实验部分
    第一章 孔雀石绿降解菌的分离鉴定及其生长和降解特性研究
        1 材料与方法
            1.1 菌株、培养基与试剂
            1.2 降解菌株的富集、分离与纯化
            1.3 降解菌株的16S rDNA序列分析
                1.3.1 降解菌株总DNA的提取
                1.3.2 降解菌株16S rDNA的PCR扩增
                1.3.3 PCR产物的T/A克隆
                1.3.4 感受态细胞的制备和转化
                1.3.5 质粒DNA的小量提取
                1.3.6 16S rDNA序列测定
            1.4 降解菌株系统发育地位的确定
            1.5 降解菌株的形态特征及生理生化鉴定
            1.6 菌体生长量的测定
            1.7 孔雀石绿含量的测定
            1.8 无色孔雀石绿含量的检测
            1.9 MDB-1对其它染料的降解
        2 结果与分析
            2.1 孔雀石绿检测方法的验证
            2.2 环境样品中孔雀石绿降解菌株的分离筛选
                2.2.1 孔雀石绿降解菌株的初筛
                2.2.2 孔雀石绿降解菌株的复筛
            2.3 MDB-1的菌落和个体形态
            2.4 MDB-1的16S rDNA序列分析
                2.4.1 基因组DNA的提取
                2.4.2 MDB-1的系统发育地位的确定
            2.5 MDB-1的生理生化特性
                2.5.1 MDB-1与近缘种的比较
                2.5.2 MDB-1对95种碳源的利用
            2.6 环境条件对降解菌株MDB-1生长的影响
                2.6.1 温度对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.2 pH对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.3 装液量对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.4 NaCl对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.5 不同碳源对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.6 不同氮源对菌株MDB-1生长的影响
                2.6.7 MDB-1对抗生素的耐受性
            2.7 MDB-1在最适生长条件下的生长曲线
            2.8 MDB-1对孔雀石绿的降解
            2.9 环境条件对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.1 孔雀石绿起始浓度对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.2 初始pH值对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.3 温度对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.4 装液量对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.5 接种量对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.6 不同碳源对MDB-1降解孔雀石绿的影响
                2.9.7 不同氮源对MDB-1降解孔雀石绿的影响
            2.10 MDB-1在低浓度孔雀石绿下的降解
            2.11 MDB-1在连续添加孔雀石绿情况下的降解情况
            2.12 MDB-1降解对其他染料的降解
        3 讨论
        本章小结
        参考文献
    第二章 孔雀石绿降解关键基因的克隆及其侧翼序列分析
        1 材料与方法
            1.1 培养基与试剂
            1.2 菌株与质粒
            1.3 菌体总DNA和质粒DNA的提取
            1.4 三苯甲烷还原酶基因的引物设计和PCR扩增
            1.5 侧翼序列SEFA-PCR引物设计和PCR扩增
            1.6 产物的酶连、转化与阳性克隆的筛选
            1.7 序列测定、比较与分析
        2 结果与讨论
            2.1 PCR法克隆三苯甲烷还原酶基因
            2.2 序列测定与比较分析
                2.2.1 基因水平上的比较
                2.2.2 氨基酸水平上的比较
            2.3 tmr2基因侧翼序列的扩增及分析
            2.4 对tmr2基因上下游序列的分析
        本章小结
        参考文献
    第三章 tmr2基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的性质研究
        1 材料与方法
            1.1 培养基与试剂
            1.2 菌株与质粒
            1.3 三苯甲烷还原酶基因tmr2的PCR扩增
            1.4 三苯甲烷还原酶基因表达载体的构建
                1.4.1 PCR产物和pET29a载体双酶切
                1.4.2 酶切产物的纯化、酶连、转化与筛选
            1.5 重组酶的表达和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
                1.5.1 重组酶的表达和样品处理
                1.5.2 聚丙烯酰胺凝胶的灌制
                1.5.3 电泳
                1.5.4 染色脱色
            1.6 重组蛋白酶液的制备和纯化
            1.7 蛋白含量的测定
            1.8 重组蛋白酶活性的检测
            1.9 三苯甲烷还原酶的酶活力测定
            1.10 三苯甲烷还原酶反应时间与酶浓度的确定
            1.11 三苯甲烷还原酶对NADH及NADPH的依赖性试验
            1.12 反应条件对三苯甲烷还原酶活性的影响
                1.12.1 温度对三苯甲烷还原酶活性的影响及酶的热稳定性
                1.12.2 pH对三苯甲烷还原酶活性的影响及酶的酸碱稳定性
                1.12.3 金属离子对三苯甲烷还原酶活性的影响
        2 结果
            2.1 表达载体构建
            2.2 重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
            2.3 表达蛋白的三苯甲烷还原酶活性检测和蛋白质含量测定
            2.4 三苯甲烷还原酶的反应进程曲线与酶浓度曲线
            2.5 三苯甲烷还原酶对NADH及NADPH的依赖性试验
            2.6 反应条件对酶活性的影响
                2.6.1 三苯甲烷还原酶反应的最适温度和酶的热稳定性
                2.6.2 三苯甲烷还原酶反应的最适pH和酶的酸碱稳定性
                2.6.3 金属离子对三苯甲烷还原酶活性的影响
        3 讨论
        本章小结
        参考文献
    第四章 tmr2基因在毕赤酵母中的表达及条件优化
        第一节 tmr2基因在毕赤酵母中的表达
            1 材料与方法
                1.1 菌株与质粒
                1.2 酶及生化试剂
                1.3 培养基及有关的溶液配制
                1.4 培养条件
                1.5 引物设计
                1.6 PCR反应条件和反应体系
                1.7 克隆质粒pMD18-T-AS的构建
                1.8 重组表达载体的线性化
                1.9 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
                1.10 酵母基因组DNA的提取
                1.11 重组酵母的PCR验证
                1.12 tmr2基因在毕赤酵母中的诱导表达
                1.13 表达蛋白的SDS-PAGE分析
                1.14 表达蛋白酶谱检测
                1.15 表达蛋白酶活性的检测
            2 结果与讨论
                2.1 表达载体构建
                2.2 tmr2基因在毕赤酵母中表达蛋白的SDS-PAGE分析
                2.3 表达蛋白的酶谱分析
                2.4 表达蛋白的活性检测
        第二节 酵母表达条件的优化
            1 材料和方法
                1.1 菌种
                1.2 培养基
                1.3 酵母工程菌表型的鉴定
                1.4 摇瓶中表达重组蛋白
                1.5 培养上清液中表达产物的酶活测定
                1.6 上清液中表达产物的蛋白含量测定
            2 结果
                2.1 酵母工程菌Mut+/Muts表型鉴定
                2.2 培养基的筛选
                2.3 不同诱导时间下酵母细胞的生长和上清液酶活
                2.4 pH值的影响
                2.5 菌体密度的影响
                2.6 甲醇诱导浓度的影响
                2.7 优化后菌体的生长和上清液酶活
            3 讨论
        本章小结
        参考文献
全文总结
附录1 实验用培养基及分子生物学试剂
    一、培养基
    二、试剂
附录2 研究中获得的相关DNA序列
攻读博士学位期间发表的论文目录
致谢

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本文编号：2863161