构建基因工程菌降解生物滞留池中多环芳烃的研究

发布时间：2020-10-31 20:33

　　 生物滞留池在收集雨水径流的过程中会截流其中的多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)并形成污染,研究适宜的降解方法有助于降低其造成的持久生态风险。本研究在解析生物滞留池中PAHs污染特征及微生物群落结构的基础上,筛选出土著优势菌种作为受体菌,将外源PAHs高效降解基因重组至其基因组,提升原有土著优势菌的PAHs降解能力。同时,向菌株胞内导入可调控的自毁系统,实现特定情况下对菌株的诱导自毁目的,控制其应用过程中潜在的生物安全风险。生物滞留池土壤中16种PAHs的总含量介于0.32±0.11~9.76±4.71 mg/kg之间,以高环数种类(尤其是芘)为主。群落结构分析表明雨水径流的汇入显著地提高了生物滞留池土壤中的微生物丰度和多样性,索氏菌属(Thauera)、丛毛单胞菌属(Comamonas)及假单胞菌属(Pseudomonas)是其中的优势菌属。本研究筛选富集出一株假单胞菌,命名为Pseudomonas sp.GLB3(KT804567),作为生物滞留池土壤中的土著优势菌。从Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌株中定位到一段芘的高效降解基因—RHD2,通过重叠PCR实现了其与绿色荧光蛋白(Gfp)基因的融合,并通过三亲结合的方式将其重组进入Pseudomonas sp.GLB3菌株的基因组,实现对土著菌的基因工程改造并提升了其对PAHs的降解能力。随后,将核酸水解酶基因nuc插入到lac启动子下游,构建了可受IPTG诱导的核酸水解酶表达系统。将该系统导入重组菌基因组后,成功构建了一株可受IPTG诱导自毁并具有PAHs降解能力的基因工程菌Pseudomonas sp.GLEKB(保藏号CCTCC:13014)。该基因工程菌对芘的降解率在为期6天的摇瓶实验中高达76.4%,且其所携带功能基因RHDGfp的表达量在降解过程中与芘的降解效率显著相关。模拟生物强化修复试验表明,本研究所构建的基因工程菌株Pseudomonas sp.GLEKB对环境的适应能力强,在模拟生物滞留池中可以保持稳定的生长优势地位,90天内芘的总体降解率达到70.5%。另外,该菌株还成功地展现出被IPTG诱导自毁的能力,降低了其向周围环境中扩散的风险。
【学位单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：

天内的自然降解率小于 15%，降解作用及其微弱。且上述研究对参与其中的微生物种类、PAHs 降解机理均没能给出明确的解释。图1.1 生物滞留池结构示意图及实地应用

第 1 章 绪论7图1.2 萘的细菌好氧降解途径上世纪 80 年代末，陆续报道出多种可以降解四环及以上 PAHs 的菌种[99-101]，并且得益于核磁共振技术以及质谱检测技术的发展，高环数 PAHs 的中间代谢产物得到了越来越准确的鉴别。芘通常被当做高环数 PAHs 的代表，研究表明其兼具单加氧与双加氧降解途径[102, 103]。在芘的单加氧降解过程中，会生成其甲基化产物或者不可降解的萘嵌苯酮；而在主流的双加氧途径中，芘会在 4、5 位发生双加氧作用，生成顺式二氢二醇产物，继而再通过脱氢、双加氧作用完成开环，并通过脱氧作用脱去羧基

第 1 章 绪论8图1.3 芘的细菌好氧降解途径而针对五环以上 PAHs 降解途径的研究较少，并且几乎全部集中于 三致效应最强的苯并芘[106-108]。研究表明，苯并芘只能通过共代谢作用进行降解，Gibson 等[109]以琥珀酸、联苯以及苯并芘作为底物培养一株拜叶林克氏菌，从菌液中鉴别出了苯并芘的两种中间代谢产物：顺-9,10-二氢二醇-苯并芘以及顺-7,8-二氢二醇-苯并芘，但却没有发现开环产物[110]。Schneider 等[111]的研究表明，在共代谢作用下，苯并芘可以在 4,5
【参考文献】

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本文编号：2864473