典型畜禽养殖环境中抗生素耐药基因的污染特征与扩散机理研究

发布时间：2020-11-04 23:34

　　 近年来,抗生素耐药性被认为是一个危害公共健康的全球性问题。抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)已逐渐被作为一类新型环境污染物而备受关注。ARGs可通过水平转移和垂直传播从人和动物源进入受纳环境。畜禽养殖业中抗生素的大量使用促进了ARGs的产生和传播扩散。畜禽粪便、粪水回用农田土壤,可增加ARGs从动物源到环境的输入。但ARGs在畜禽养殖环境中的污染特征及其向受纳环境的迁移过程机理尚不清楚,因此,有必要开展典型畜禽养殖环境中ARGs的多样性分布特征和传播扩散机制研究。本研究选取不同养殖模式的肉鸡养殖环境、集约化养猪场及其受纳环境作为研究对象,系统研究了抗生素和抗生素ARGs在养殖动物粪便、废水、养殖场周边土壤、种植作物以及受纳河流水体和沉积物中的污染特征;探讨了ARGs组成的时空分布特征和各环境因子(抗生素、金属和环境质量参数)之间的关系;并采用16S rRNA基因测序和宏基因组测序深入解析了ARGs和细菌耐药性在典型养殖环境中的迁移扩散规律。本研究主要的研究成果如下:(1)采用实时荧光定量PCR技术,表征了两种典型肉鸡养殖模式(山地放养和室内平养)11个肉鸡场环境样品中介导氯霉素类、磺胺类和四环素类ARGs的含量和分布特征。通过Pearson相关性分析和多因子冗余分析(RDA)进一步分析了ARGs可能的分子传播过程和环境影响因素(抗生素残留、金属含量及常见环境质量参数)。定量结果表明,ARGs广泛分布于肉鸡粪便、垫料、土壤、池塘水和沉积物中,能够在粪便或垫料中富集,并长期存在于养殖环境介质中,其中氯霉素类和磺胺类ARGs检出含量高于四环素类ARGs。室内平养模式和山地放养模式下的ARGs丰度特征各异,表明养殖方式对ARGs的产生和传播扩散有重要影响。Pearson相关性分析显示,ARGs与1类和2类整合子的整合酶编码基因呈现显著正相关,表明移动元件对ARGs的传播扩散起到一定作用。同时不同作用机制类型ARGs之间的显著相关性则表明多重耐药、共选择及协同传播等分子机制可能有助于其在肉鸡养殖环境中的传播。进一步的线性回归分析结果表明,fexA、sul1和tetW基因可作为肉鸡养殖环境中ARGs的污染指示基因(fexA、sul1和tetW与所有ARGs总值相关系数分别为:0.95、0.96和0.86,p0.01)。冗余分析结果显示,ARGs的环境分布受到抗生素残留、金属含量和常见环境质量参数的影响,表明ARGs的传播扩散与环境化学因子相关。(2)考察了磺胺类、四环素类、氯霉素类和大环内酯类共计22种ARGs以及18种对应抗生素在典型养猪场环境中含量水平和污染特征。结果表明,args和抗生素在生猪养殖环境中普遍存在,大部分args和抗生素通过养猪场内的废水处理单元无法有效去除。args随废水排放和粪肥回用进入河流和农业土壤后呈现组成多样性增加的趋势。args在农田土壤垂直剖面上呈现出向下富集的趋势,表明其垂直迁移性。另外,需要特别关注的是args及部分抗生素在种植蔬菜中均有检出,说明养猪场粪便和废水回用可能对食品安全和人体健康形成的潜在影响。(3)通过比较分析养猪场、养鸡场及相应受纳环境中26个args和2个整合酶基因的分布特征,探讨了不同养殖类型对受纳环境的影响。结果表明,猪粪比鸡粪负载更多的args(p0.01),两类养殖场对受纳土壤args的输入在总量上稍有体现,并且猪场的输入量大于鸡场。args检出率在两类粪便及其受纳土壤中的检出率显著高于对照土壤。两类粪便中args的多样性与其对应受纳土壤中的args多样性相当。但值得注意的是,猪场受纳土壤中args多样性显著高于对照土壤(p0.05),而鸡场受纳土壤的多样性仅略高于对照土壤(p0.05)。不同类型养殖场对受纳土壤的影响进一步体现在args的多样化程度上,相比而言,猪场比鸡场更易促进args在土壤中的多样化进程。总体而言,args在两类养殖场水体环境中的相对含量分布差异较大,养猪场高于养鸡场,水相高于沉积物相,养猪场对周边环境的影响大于养鸡场。(4)基于16srrna高通量测序,分析了养猪废水处理过程及其出水灌溉对土壤及其种植蔬菜微生物群落结构的影响。结果显示,养猪废水经过储污池、沼气池等单元处理后,微生物群落多样性指数有所升高。蔬菜清洗后仍可发现较多微生物群落。与对照样比较,猪场地下水(井水)、蔬菜地土壤、鱼塘水及其沉积物的微生物组成差异显著。89种菌群在蔬菜土壤中得到了富集,养猪废水和蔬菜土壤共有19个核心菌群,废水中检出动物肠道来源的变形菌门、拟杆菌门、厚壁门细菌等。养猪废水灌溉农田不仅将args、多种潜在病原微生物从养猪场输入到环境中,也对水、土、及农作物微生物结构产生影响,进而可能对生态环境与人群健康形成潜在威胁。(5)采用宏基因组学测序技术对经猪粪水灌溉的蔬菜地土壤柱(表层、中层、底层土)中args组组成和垂直迁移扩散机理进行了深入解析。通过宏基因测序共获得79种args基因型,分属于12大类。猪场蔬菜地表层、中层、底层土的args数量比对照菜地分别高出5.70倍、14.7倍、5.93倍。猪场菜地的灌溉水则比对照地的高出11.9倍。值得注意的是,两类菜地底层土的args序列总量均高于中层土和表层土。灌溉水中差异最大的args是四环素类,其次是氨基糖苷类和mlsb。氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类和四环素类是表层土中相差较大的ARGs类别。多药外排泵、磺胺类、四环素类在中层土中相差较大,而氨基糖苷类、杆菌肽和磺胺类在底层土中的差异较突出。整个土壤柱样相差最大的是磺胺类,其次是四环素类、多药外排泵。8个样品共获得59种潜在病原菌,分属于8个门、12个纲、18个目、27个科、30个属;病原菌在种(species)分类水平上,土壤表层、中层、底层剖面上的差异倍数范围在-0.38~64.0倍、0.58~200倍、-1.00~1.94倍。8个样品共获得451种耐药菌,分属于18个门、35个纲、79个目、150个科、254个属。耐药菌在种(species)分类水平上,土壤表层、中层、底层剖面上的差异倍数范围在-1.00~255倍、-1.00~848倍、-1.00~113倍。Piper三线图显示了12类ARGs和150个科水平上的耐药菌在土壤剖面上的分布格局。绝大多数耐药菌在对照土壤柱样中主要分布在底层,部分菌种可在三层均匀分布;而耐药菌在猪场蔬菜地三层土壤中的分布较为均匀。ARGs与耐药菌的分布呈现出相似的格局:在对照菜地中主要分布在表层、底层;而猪场菜地中三层均有分布。以上结果表明,微生物种群分布特征主导了ARGs在土壤中的分布格局,对土壤耐药基因组的演化起重要作用。
【学位单位】：中国科学院研究生院(广州地球化学研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：X713
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
中英文对照及缩略词表
第一章 绪论
    第一节 抗生素及其在畜禽养殖中的应用
        一、抗生素种类、作用机制及其在畜禽养殖中的应用
        二、抗生素在畜禽养殖环境中的分布和影响
    第二节 抗生素耐药性
        一、抗生素耐药机制和代表性耐药基因
        二、耐药基因的迁移与传播扩散机制
        三、耐药基因的研究方法
    第三节 抗生素耐药基因在畜禽养殖环境中的污染特征
        一、畜禽养殖废弃物的处理与资源化利用
        二、畜禽养殖环境中抗生素耐药基因的污染水平
    第四节 研究意义、思路和内容
        一、研究意义
        二、研究思路和内容
第二章 研究方法
    第一节 研究区域
        一、养鸡场
        二、养猪场
    第二节 样品采集
        一、采样前期准备
        二、样品采集与前处理方法
        三、养鸡场样品采集
        四、养猪场样品采集
        五、土壤柱及其灌溉水样品采集
        六、蔬菜样品采集与前处理
        七、样品总清单
    第三节 化学分析
        一、常规环境质量参数
        二、金属含量
        三、抗生素
    第四节 生物分析
        一、样品总DNA提取
        二、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）
        三、耐药基因荧光定量PCR检测（SYBR® Green I染料法）
    第五节 数据处理与统计分析
        一、描述性统计分析
        二、香农多样性指数
        三、基于生态学数据处理的双向聚类样品分级
        四、基于生态学数据处理的多变量分析
    第六节 16S rRNA基因测序与生物信息学分析
        一、16S rRNA基因测序实验流程
        二、基于 16S rRNA基因测序的微生物多样性分析
    第七节 宏基因组测与及生物信息学分析
        一、宏基因组测序实验流程
        二、宏基因组测序生物信息学分析
第三章 抗生素耐药基因在肉鸡养殖环境中的污染特征
    第一节 结果
        一、肉鸡养殖环境中耐药基因的污染特征
        二、肉鸡养殖环境中的抗生素和金属的污染特征
        三、肉鸡养殖环境中耐药基因与金属、抗生素及环境质量参数的相关性分析
        四、耐药基因含量分布与环境因子的多变量分析
    第二节 讨论
        一、两种养殖模式下耐药基因的分布特征和分子传播机制
        二、养殖环境中耐药基因污染指示基因的筛查
        三、环境因子对耐药基因时空分布的影响
    第三节 小结
第四章 抗生素耐药基因在生猪养殖环境中的污染特征
    第一节 结果
        一、水样、土壤样品常规质量指标与金属含量
        二、耐药基因在养猪场及其受纳环境中的分布特征
        三、耐药基因在蔬菜中的分布特征
        四、抗生素在养猪场环境中的分布特征
    第二节 讨论
        一、耐药基因从养猪场到受纳环境的传输和扩散过程
        二、养猪场对受纳环境中抗生素和耐药基因的输入与影响
    第三节 不同养殖类型对受纳环境中耐药基因输入的影响差异
    第四节 小结
第五章 养殖废水处理与灌溉过程中耐药基因和微生物种群结构的演变过程
    第一节 16S rRNA测序结果与讨论
        一、各样本测序数据统计
        二、OTU聚类与微生物组成分析
        三、多样本相似度分析
        四、群落结构与耐药基因的关联性分析（考虑是否去掉）
        五、微生物群落LefSe差异统计分析
    第二节 宏基因组测序结果与讨论
        一、环境质量参数、ARGs及抗生素含量水平
        二、宏基因组测序基础数据统计
        三、微生物群落组成结构特征
        四、潜在病原菌组成结构特征
        五、潜在耐药菌组成结构特征
        六、COG功能注释
        七、耐药基因注释
        八、耐药基因与耐药菌在土壤柱中的分布格局
    第三节 小结
第六章 全文结论及创新之处
    第一节 主要结论
    第二节 主要创新之处
    第三节 不足之处
    第四节 研究展望
参考文献
作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果

【引证文献】

相关硕士学位论文 前4条

1 袁素芬;微污染化学物质分析方法的建立及其应用[D];华南理工大学;2017年

2 李新;纤维素对污泥中多环芳烃厌氧生物降解的影响研究[D];贵州大学;2017年

3 赵晶;施有机肥对土壤及生菜中耐药非致病菌及耐药基因的影响研究[D];华东师范大学;2017年

4 史亚楠;重金属铜锌对病原菌及环境细菌耐药性的影响[D];广东药科大学;2017年

本文编号：2870770