正壬基酚及其同分异构体对小鼠Sertoli TM4细胞的影响及其分子机制的研究

发布时间：2020-11-09 00:31

　　 壬基酚(Nonylphenols,NPs)是一种环境毒性物质和内分泌干扰物,可对雄性生殖系统产生危害。事实上,壬基酚并不是单一的化合物,而是带有一个苯环和九碳侧链化合物的总称,因此壬基酚存在多种同分异构体。其中,九碳侧链位于羟基对位的壬基酚被称为对壬基酚或者是4-壬基酚,是最常见的壬基酚形式且是研究的重点对象,九碳侧链为直链的4-NP称为正-NP(4-n-NP)。壬基酚异构体的生物效应与其结构具有一定的相关性,因此有必要研究单个壬基酚的生物活性。环境内分泌干扰物主要通过两种机制发挥作用,一是通过激活细胞信号转导通路引起细胞的增殖或者凋亡;另一个是通过激素受体介导引起内分泌干扰作用。本论文以正壬基酚(4-n-NP)以及12种4-NP异构体单体为研究对象,以Sertoli TM4细胞为靶细胞,运用细胞和分子生物学技术,从细胞信号转导通路和内分泌干扰两个方面研究4-NP异构体对TM4细胞的影响及其相关的分子机制,并通过比较差异探讨4-NP异构体的侧链结构与其活性的相关性。本文主要研究内容和结论归纳如下:1.4-NP异构体对Sertoli TM4细胞的细胞毒性作用采用MTT法检测细胞存活率以及流式检测细胞凋亡,结果发现,在低浓度时,NP9、NP10以及NP37促进TM4细胞的生长,4-n-NP、NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194处理显著诱导TM4细胞的凋亡,由此可见除4-n-NP外,壬基取代基主碳链长、取代基支链小(甲基)的壬基酚异构体可促进TM4细胞增殖;碳链越短、α-C位置取代基基团越大越复杂的壬基酚异构体对Sertoli TM4细胞凋亡的诱导越强。4-NP异构体主要是通过引起细胞氧化损伤以及与ROS生成相关的线粒体信号通路诱导细胞凋亡。在80-100μM时,所有4-NP异构体通过直接毒性作用显著降低TM4细胞的存活率。2.4-NP异构体对Sertoli TM4细胞内钙离子稳态的影响用4-NP异构体处理细胞24 h后检测细胞内钙离子浓度变化及引起其变化的相关机制。结果发现,NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194暴露能够上调TM4细胞内钙离子浓度,其中NP65、NP70、NP111、NP152作用显著。4-NP异构体对Sertoli TM4内钙离子的调控作用与Ca2+-ATPase活性,钙泵功能,钙离子通道激酶等因素有关。可见壬基酚取代基复杂、体积大(具有乙基或丙基取代基)的异构体易导致tm4细胞内钙离子浓度紊乱。3.4-np异构体对sertolitm4细胞内mapk、akt信号转导通路的影响采用westernblot的方法检测了4-np异构体对细胞内mapk信号通路和akt信号通路的影响。4-n-np、np41、np42、np65、np111、np112、np143、np152均能激活jnk信号通路;4-n-np、np111、np112、np143、np152、np194能够激活p38信号通路;np143、np152、np194对erk信号通路无影响,其他异构体激活或抑制erk通路。4-n-np抑制akt信号通路,其他所有检测的np异构体能够激活akt信号通路。除4-n-np外,壬基取代基大、α-c处取代基复杂的异构体可激活jnk、p38信号通路,而对erk信号通路无影响;碳链长、壬基取代基简单的异构体主要表现抑制jnk、p38信号通路。4.4-np异构体对sertolitm4细胞激素受体和分泌功能的影响4-n-np能够降低tm4细胞内er-β的表达,下调细胞连接相关分子的表达,上调abp的分泌,下调inhibinb的分泌,且能增加tm4细胞对il-1α、tnf-α、tgf-β1等的分泌,降低tm4细胞对no的分泌和inos的表达。12种4-np异构体对tm4细胞激素受体、连接相关分子的表达以及内分泌功能均具有不同程度的影响,4-np异构体可通过激素受体、连接相关分子的表达以及内分泌功能对tm4细胞产生损伤。5.4-np异构体对sertolitm4细胞内激素分泌及其分子机制的研究4-np异构体作用于细胞后,以pge2为代表观察4-np异构体对tm4细胞分泌激素的影响及其机制。研究结果发现,4-n-np、np10、np41、np42、np70暴露能够诱导tm4细胞内cox-2的表达和pge2的释放;np9、np37、np65对tm4细胞内pge2的释放无显著影响;np111、np112、np143、np152、np194可抑制tm4细胞对pge2的释放。可见,壬基取代基主链长(6-7)且在β-c有取代基的异构体刺激cox-2的表达和pge2、il-6的分泌;侧链主链短(4-5)、在α-c处取代基比较大且复杂(乙基或丙基)的np异构体抑制tm4细胞分泌pge2和il-6。4-n-np通过ros诱导的nf-κb信号通路调节cox-2的表达和pge2的释放。综上所述,4-np异构体能够通过细胞信号转导通路(包括线粒体细胞凋亡信号通路,钙离子通道以及mapk、akt信号通路)和内分泌干扰作用(包括对激素受体,细胞连接相关分子以及内分泌的影响)对sertolitm4细胞发挥作用,且各异构体对TM4细胞各方面的影响存在一定差异,壬基酚异构体对Sertoli TM4细胞的影响可能与其侧链结构的链长、大小、α-C和β-C处取代基等因素有关。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：X592
【部分图文】：

本研究总体思路图

图 2.1 4-n-NP 及 12 种 4-NP 异构体的结构式。*代表手性碳原子。Fig 2.1 Structures of 4-n-NP and 4-NP isomers. *represents chiral carbon atom.NP152NP143NP194

-n-NP 对 TM4 细胞内钙离子浓度的影响。通过流式采用 Fluo-3/AM 检测，检测 20000 个细胞。 4-n-NP-induced Ca2+release in TM4 cells. The appearance of Ca2+release wasow cytometry using Fluo-3/AM fluorescent probe. For each sample, 20,000 cellanalyzed.-NP 异构体对 TM4 细胞凋亡的影响 不同浓度 NP65对 Sertoli TM4 细胞凋亡的影响S 的过量生成是氧化应激的一个指示剂，氧化应激被认为是细胞个主要机制，本研究中采用流式检测了 NP65对 Sertoli TM4 凋亡察了 ROS 在 NP65诱导细胞凋亡中的作用，结果如图 2.6 所示，T处理24 h后，凋亡细胞在10 和 20 μM NP65处理组显著增加（P <低浓度 NP65处理组（0.1 和 1 μM），凋亡细胞比例与对照组无显定 ROS 是否参与了 NP65对 TM4 细胞的凋亡作用，本研究在 NP6

本文编号：2875596