产PHA优势菌群富集机制与三段式混菌工艺优化研究

发布时间：2020-11-11 09:33

　　 石油基塑料除因其难降解特性而对生态环境造成持久性的危害之外,又以“塑料微粒”这样一种新的污染形式影响自然界的食物链,随着时间的积累,石油基塑料对地球生物圈的影响会更加严重和深远,寻找应对策略已经刻不容缓。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种由细菌合成的胞内聚酯,具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性。目前市场上可见的PHA产品主要来自于纯菌株发酵技术,近20年来基于环境生物技术的混合菌群(MC)PHA合成工艺由于其潜在的污染物处理、资源回收及成本低廉等特点而受到较多关注。但是,目前仍存在着若干重要的因素限制了工艺的规模化应用,课题基于系统稳定性缺乏理论支撑、合成效率低下以及工艺整体层面的产物组成调控策略缺失这些制约因素从微生物生态学、代谢机制以及工艺效能层面开展了针对性的研究。三段式工艺是最成熟的混菌PHA合成工艺形式,作为三段式工艺的核心,产PHA菌的富集机制不够清晰,缺乏富集工艺稳定性的理论解析。本论文首先在饱食-饥饿(F-F)工艺模式下考察了富集过程中混合菌群功能的变化和群落的演替,分析了两者的关联性,结果表明,接种活性污泥后,在使用不同典型底物的三组富集反应器中,菌群的功能均表现出PHA合成能力快速攀升及菌群絮体物理性质由波动转为稳定的变化趋势,菌群的演替过程呈现非产PHA优势菌的淘汰和产PHA优势菌的更迭的规律。对PHA聚合酶基因pha C的定量分析发现,在成熟期虽然群落持续演替,但PHA合成菌能够以一种“承接”的方式保持菌群整体PHA合成能力的稳定。研究还发现,具有特殊胞外多糖分泌倾向的Thauera属产PHA菌的增殖导致了菌群絮体沉降性的波动,但也因这样的代谢特质,该菌被PHA合成更为专一的Paracoccus属产PHA菌竞争性淘汰。研究阐明了F-F模式下产PHA菌的富集机制:基于底物充盈/匮乏的选择压力在整个富集期占据主导,驱动产PHA优势菌占据生态系统并在优势菌更迭期间保持了功能基因的稳定,噬菌体-细菌作用机制极有可能导致了优势菌在成熟期的大幅更替,研究结果证明F-F模式下富集系统具备理论上的稳定性。研究提出了改善富集期菌群絮体稳定性的工艺策略,并根据菌群功能参数的关联性初步建立了富集系统的评价体系。针对三段式工艺PHA积累合成段底物p H需预调节以及碳源利用效率低的问题,本论文提出了低负荷连续流补料的PHA合成工艺模式,在生物量负荷(BLR)处于3.5-5.5 Cmol VFA/Cmol X/d(对应的有机负荷为3.2-5.3 g COD/g VSS/d)时,底物(p H 5~10)无需任何p H调节而直接补加。由于该工艺条件下系统p H值可稳定维持在PHA合成的适宜范围(p H 8~9)内,这种p H自平衡状态不但简化了操作更获得占细胞干重70.36%的最大PHA合成比例(PHAm)。研究发现,PHAm与比PHA合成速率之间并没有直接的关联,因此在低负荷条件下营造的底物“供小于求”的状态可以获得高效的底物利用效率(0.81 Cmol PHA/Cmol VFA)。传统三段式工艺产PHA菌富集段稳定运行的代价是生物量的低输出,由此带来的低PHA产率将会限制混菌工艺的规模扩大。本论文提出了碳源、营养元素分段补加的产PHA混菌扩大培养工艺策略来解决这一矛盾,在优化条件下,扩培试验可以在10天的扩培期将生物量扩增43倍,同时能够强化菌群的产PHA能力。将扩培工艺段嵌入三段式工艺产PHA菌富集段和PHA积累合成段之间可以大幅提升工艺的产率,理论上工艺整体PHA容积产率可以达到1.21 kg PHA/m3/d,这意味着为了获得相同的菌群产量,在相同的有机负荷和SRT下,传统的三段式工艺需要将富集反应器的有效工作容积增加53倍。在运行稳定和效能提升的基础上,混菌PHA工艺的规模化应用还需要考虑PHA产品质量的调控。PHA中HB和HV单体的相对比例能够显著影响PHA的物化特性,且提升HV单体比例可以改善产品的加工性能。选取乙酸型、丙酸型和丁酸型底物富集的混合菌群M-Ac、M-Pr和M-Bu,研究了不同富集菌群在PHA积累合成段底物组分变化时的PHA产物组成和PHAm。结果表明,虽然PHA产物中HB与HV相对比例对底物组分的变化响应敏感,但菌群的PHAm在底物中丙酸比例提升时受到明显抑制。三种菌群在底物组分变化条件下PHA合成能力的稳定性顺序为:M-PrM-AcM-Bu,且在PHA积累合成段以乙酸和丙酸为主的底物组合体系具有最佳的PHA结构调控效果。结合菌群结构特性和代谢通量分析,解析了三种富集菌群PHA合成响应差异的机理:菌群M-Pr在丙酰辅酶A脱碳转化为乙酰辅酶A路径上较高的代谢通量(0.06 Cmol/Cmol X/h)是其耐受高丙酸浓度的根本原因。在优化PHA产物结构的背景下,从工艺整体层面提出了产PHA菌富集段和PHA积累合成段底物组分的优化方案。与此方案相对应,底物准备段对废弃生物质发酵产物组分的调控成为技术需求,研究最后提出了基于响应曲面设计的剩余污泥定向产酸工艺策略,使用半连续发酵和PHA合成试验验证了该调控策略的可靠性和有效性。
【学位单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X705;X172
【部分图文】：

1-1 鱼类幼体分别暴露在在无（a、b）、中浓度（c、d）以及高浓度（e、f）塑料微粒环境下对微粒的摄入倾向[8]以及塑料微粒可能在海洋食物链中的归趋（g）Fig.1-1 Consumption tendency of fish larvae for micro-plastics in environment with differentconcentration of micro-plastics (blank-a, b; medium-c, d; high-e, f) and possible fate of micro-plastics in the marine food chain海洋塑料污染已成为与气候变化、臭氧层破损、海洋水体酸化并列的全球环境题。考虑到塑料垃圾的种种潜在危害已经变成现实，其带来的环境问题甚至比原预测的更为严重和深远，因此已有学者提出将塑料垃圾划归为危险废物[9]。1.2.2 应对策略传统石油基塑料垃圾在地球生态圈中的基数巨大，一方面消耗着不可再生的石资源，另一方面又造成了日益严重的环境威胁，因此寻找针对塑料污染的应对略已经刻不容缓。科研工作者们也在塑料制品生命周期的各个阶段针对性地提了一些解决方案。自 2014 年起北京航空航天大学的杨军团队和斯坦福大学的吴民团队共同连续发表了多篇关于利用黄粉虫吞食降解传统石油基塑料的研究论[10-12]，引起了多方关注。黄粉虫能够摄取聚苯乙烯类塑料制品（塑料泡沫），其

料危害的策略：（a）利用黄粉虫吞食降解聚苯乙烯塑料[11]；物降解材料[13] solve pollutions of conventional plastics: (a) using mealworm t(b) using biodegradable material as substitute具有石油基塑料降解能力的生物是在塑料生命周期的而研发与传统塑料理化性质相似又能够被生态圈微料则可以从源头解决塑料危机（图 1-2b）。可生物降

图 1-3 PHA 聚合物（均聚物和共聚物）结构通式Fig.1-3 General molecular formula of PHA(including homopolymer and copolymer)于 PHA 单体中碳原子的数量可以将 PHA 聚合物分为[21]：1）短链 PHA（S单体碳原子数为 3-5 个，如表 1-1 中的均聚物 PHB、PHV 及 P（4HB） PHBV；2）中长链 PHA（MCL-PHA），单体碳原子数为 6-14 个，如表
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本文编号：2879034