Pseudomonas sp. WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的机理研究
发布时间：2020-12-04 00:33
硝基芳香烃化合物是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等合成的前体。这类化合物能在环境中长期残留，已经对土壤、水体和大气造成了严重的污染。硝基芳香烃化合物能影响人体的物质代谢，有致癌、致畸和致突变等危险，严重威胁着人类的健康和生存。苯环结构的对称性和稳定性使硝基芳香烃化合物不易发生化学反应，而环境中的许多微生物却能够利用这些污染物作为唯一的碳源、氮源和能源来生长，能把这些污染物完全降解。微生物的这一特性使其在污染物的生物治理和生物修复中具有难以替代的优势，因而越来越受到人们的青睐。同时，对这些微生物的代谢途径和代谢基因的研究也成为本领域研究的热点。本论文的研究工作分为以下三个部分。第一部分是Pseudomonas sp．WBC-3对4-硝基酚的代谢途径研究。WBC-3是一株能够利用甲基对硫磷（Methyl Parathion，MP）和4-硝基酚（4-Nitrophenol，4-NP or PNP）做为唯一碳源、氮源及能源生长的革兰氏阴性菌。WBC-3降解MP的第一步是在甲基对硫磷水解酶（Methyl parathionhydrolase，MPH）的作用下生成4-硝基酚，然后再由其它的...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)湖北省
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言——硝基芳香烃化合物的微生物代谢途径及机理研究
1.1 硝基苯（Nitrobenzene）的代谢途径
1.1.1 部分还原途径
1.1.2 双加氧途径
1.1.3 硝基苯下游代谢途径比较
1.2 硝基苯甲酸（nitrobenzoates,NBA）的代谢途径
1.2.1 2-硝基苯甲酸的代谢途径
1.2.2 3-硝基苯甲酸的代谢途径
1.2.3 4-硝基苯甲酸的代谢途径
1.3 硝基甲苯（Nitrotoluene）的代谢途径
1.3.1 2-硝基甲苯的代谢途径
1.3.2 3-硝基甲苯的代谢途径
1.3.3 4-硝基甲苯的代谢途径
1.3.4 2,4-二硝基甲苯（2,4-dinitrotoluene,2,4-DNT）的代谢途径
1.3.5 2,6-二硝基甲苯（2,6-dinitrotoluene,2,6-DNT）的代谢途径
1.3.6 三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotolene,TNT）的代谢途径
1.4 硝基酚（Nitrophenol,NP）的代谢途径
1.4.1 3-硝基酚的代谢途径
1.4.2 2-硝基酚的代谢途径
1.4.3 2,4,6-三硝基酚（2,4,6-trinitrophenol,TNP）的代谢途径
1.4.4 二硝基酚（Dinitrophenol,DNP）的代谢
1.4.5 有机磷农药的微生物降解
1.5 芳香烃化合物代谢途径研究的趋向
1.6 4-硝基酚（4-Nitrophenol,4-NP or PNP）的代谢途径研究进展
1.6.1 4-硝基酚的代谢途径
1.6.2 4-硝基酚代谢途径的分子生物学研究
1.7 本研究目的和意义
第2章 材料和方法
2.1 培养基
2.2 菌株及其培养方法
2.3 工具酶和试剂
2.4 分子生物学实验方法
2.4.1 常规分子生物学方法
2.4.2 染色体DNA制备
2.4.3 基因组步移（Genomic walking）
2.4.4 Pseudomonas sp.WBC-3菌中的基因敲除
2.5 酶活测定（Enzyme Assay,cell free assay）
2.6 生物转化（Biotransformation,resting cell assay）
2.7 分析方法
2.7.1 HPLC检测
2.7.2 蛋白浓度测定
2.7.3 亚硝酸根的测定
2.8 趋化试验
2.9 DNA序列测定及分析
2.10 WBC-3的质粒pZWL0的全基因组序列测定及分析
第3章 Pseudomonas sp.WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的代谢途径及代谢机理研究
3.1 WBC-3菌株降解4-硝基酚的代谢途径研究
3.1.1 WBC-3菌株4-硝基酚单加氧酶的酶活测定
3.1.2 WBC-3菌株对苯二酚双加氧酶的酶活测定
3.2 对苯二醌还原酶基因的克隆
3.3 基因组步移法克隆4-硝基酚代谢基因簇
3.4 4-硝基酚代谢基因簇的生物信息学分析
3.5 4-硝基酚单加氧酶的功能验证及酶学特性研究
3.5.1 pnpA在E.coli中的表达
3.5.2 生物转化法测定PnpA的活性
3.5.3 4-硝基酚单加氧酶的酶活测定
3.5.4 4-硝基酚单加氧酶的酶学特性研究
3.5.4.1 辅因子对4-硝基酚单加氧酶酶活的影响
3.5.4.2 4-硝基酚单加氧酶氧化4-硝基酚和NADPH的比例
3.5.4.3 4-硝基酚单加氧酶的底物范围测定
3.5.4.4 4-硝基酚单加氧酶对4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的比活测定
3.6 对苯二酚双加氧酶的功能验证
3.7 基因敲除验证 4-硝基酚代谢关键酶基因
3.8 讨论
3.8.1 4-硝基酚单加氧酶属于典型的黄素蛋白单加氧酶家族
3.8.2 对苯二醌还原酶基因在 4-硝基酚代谢途径中的作用
3.8.3 对苯二酚双加氧酶的酶学特点
3.8.4 WBC-3菌株中 4-硝基酚代谢操纵子的研究
3.8.5 4-硝基酚两种代谢途径的比较
第4章 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究
4.1 引言——微生物的趋化机理及其在环境污染物降解中的作用
4.1.1 微生物趋化的概念
4.1.2 微生物趋化的机理
4.1.3 趋化与微生物代谢的关系
4.1.4 细菌对简单芳香烃的趋化
4.1.5 细菌对萘的趋化研究
4.1.6 细菌对硝基芳香烃化合物的趋化
4.1.7 趋化在微生物降解有机污染物中的作用
4.1.8 本研究的目的及意义
4.2 实验结果
4.2.1 Pseudomonas sp.WBC-3对其可代谢芳香烃化合物的趋化
4.2.2 Pseudomonas sp.WBC-3对其非代谢芳香烃化合物的趋化
4.2.3 Pseudomonas sp.WBC-3代谢突变株的趋化特性
4.2.4 Pseudomonas sp.WBC-3对甲基对硫磷的趋化
4.3 讨论
4.3.1 WBC-3对芳香烃化合物的趋化是不依赖于代谢的趋化
4.3.2 WBC-3对芳香烃化合物的趋化属于β-ketoadipate控制的趋化系统
4.3.3 β-ketoadipate趋化系统在土壤微生物中广泛存在
4.3.4 微生物对芳香烃化合物趋化机制的研究进展
4.3.5 WBC-3对甲基对硫磷的趋化
4.3.6 趋化研究方法的进展
第5章 Pseudomonas sp.WBC-3 甲基对硫磷降解性质粒pZWL0的全序列分析
5.1 WBC-3质粒pZWL0的全序列测定及分析
5.2 甲基对硫磷水解酶基因（mph）定位在转座子上
5.2.1 转座子的分类及结构特点
5.2.2 mph转座子的结构特点。
5.3 有机磷水解酶的起源和进化
5.3.1 有机磷水解酶的分类
5.3.2 有机磷水解酶的转座子定位
5.3.3 有机磷水解酶的进化分析
5.3.4 有机磷水解酶的起源与进化历程
5.4 WBC-3质粒pZWL0中与质粒复制、传代有关的基因
5.5 WBC-3质粒pZWL0中与质粒接合转移相关的基因
5.6 WBC-3质粒pZWL0中的其它功能未知基因
5.7 WBC-3质粒pZWL0的基因组织结构特点
5.8 结论
第6章 结论和进一步工作设想
6.1 结论
6.1.1 Pseudomonas sp.WBC-3中4-硝基酚的代谢途径研究
6.1.2 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究
6.1.3 Pseudomonas sp.WBC-3的质粒pZWL0序列分析
6.2 进一步工作设想
参考文献
发表与待发表文章目录
致谢
本文编号：2896721
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)湖北省
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言——硝基芳香烃化合物的微生物代谢途径及机理研究
1.1 硝基苯（Nitrobenzene）的代谢途径
1.1.1 部分还原途径
1.1.2 双加氧途径
1.1.3 硝基苯下游代谢途径比较
1.2 硝基苯甲酸（nitrobenzoates,NBA）的代谢途径
1.2.1 2-硝基苯甲酸的代谢途径
1.2.2 3-硝基苯甲酸的代谢途径
1.2.3 4-硝基苯甲酸的代谢途径
1.3 硝基甲苯（Nitrotoluene）的代谢途径
1.3.1 2-硝基甲苯的代谢途径
1.3.2 3-硝基甲苯的代谢途径
1.3.3 4-硝基甲苯的代谢途径
1.3.4 2,4-二硝基甲苯（2,4-dinitrotoluene,2,4-DNT）的代谢途径
1.3.5 2,6-二硝基甲苯（2,6-dinitrotoluene,2,6-DNT）的代谢途径
1.3.6 三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotolene,TNT）的代谢途径
1.4 硝基酚（Nitrophenol,NP）的代谢途径
1.4.1 3-硝基酚的代谢途径
1.4.2 2-硝基酚的代谢途径
1.4.3 2,4,6-三硝基酚（2,4,6-trinitrophenol,TNP）的代谢途径
1.4.4 二硝基酚（Dinitrophenol,DNP）的代谢
1.4.5 有机磷农药的微生物降解
1.5 芳香烃化合物代谢途径研究的趋向
1.6 4-硝基酚（4-Nitrophenol,4-NP or PNP）的代谢途径研究进展
1.6.1 4-硝基酚的代谢途径
1.6.2 4-硝基酚代谢途径的分子生物学研究
1.7 本研究目的和意义
第2章 材料和方法
2.1 培养基
2.2 菌株及其培养方法
2.3 工具酶和试剂
2.4 分子生物学实验方法
2.4.1 常规分子生物学方法
2.4.2 染色体DNA制备
2.4.3 基因组步移（Genomic walking）
2.4.4 Pseudomonas sp.WBC-3菌中的基因敲除
2.5 酶活测定（Enzyme Assay,cell free assay）
2.6 生物转化（Biotransformation,resting cell assay）
2.7 分析方法
2.7.1 HPLC检测
2.7.2 蛋白浓度测定
2.7.3 亚硝酸根的测定
2.8 趋化试验
2.9 DNA序列测定及分析
2.10 WBC-3的质粒pZWL0的全基因组序列测定及分析
第3章 Pseudomonas sp.WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的代谢途径及代谢机理研究
3.1 WBC-3菌株降解4-硝基酚的代谢途径研究
3.1.1 WBC-3菌株4-硝基酚单加氧酶的酶活测定
3.1.2 WBC-3菌株对苯二酚双加氧酶的酶活测定
3.2 对苯二醌还原酶基因的克隆
3.3 基因组步移法克隆4-硝基酚代谢基因簇
3.4 4-硝基酚代谢基因簇的生物信息学分析
3.5 4-硝基酚单加氧酶的功能验证及酶学特性研究
3.5.1 pnpA在E.coli中的表达
3.5.2 生物转化法测定PnpA的活性
3.5.3 4-硝基酚单加氧酶的酶活测定
3.5.4 4-硝基酚单加氧酶的酶学特性研究
3.5.4.1 辅因子对4-硝基酚单加氧酶酶活的影响
3.5.4.2 4-硝基酚单加氧酶氧化4-硝基酚和NADPH的比例
3.5.4.3 4-硝基酚单加氧酶的底物范围测定
3.5.4.4 4-硝基酚单加氧酶对4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的比活测定
3.6 对苯二酚双加氧酶的功能验证
3.7 基因敲除验证 4-硝基酚代谢关键酶基因
3.8 讨论
3.8.1 4-硝基酚单加氧酶属于典型的黄素蛋白单加氧酶家族
3.8.2 对苯二醌还原酶基因在 4-硝基酚代谢途径中的作用
3.8.3 对苯二酚双加氧酶的酶学特点
3.8.4 WBC-3菌株中 4-硝基酚代谢操纵子的研究
3.8.5 4-硝基酚两种代谢途径的比较
第4章 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究
4.1 引言——微生物的趋化机理及其在环境污染物降解中的作用
4.1.1 微生物趋化的概念
4.1.2 微生物趋化的机理
4.1.3 趋化与微生物代谢的关系
4.1.4 细菌对简单芳香烃的趋化
4.1.5 细菌对萘的趋化研究
4.1.6 细菌对硝基芳香烃化合物的趋化
4.1.7 趋化在微生物降解有机污染物中的作用
4.1.8 本研究的目的及意义
4.2 实验结果
4.2.1 Pseudomonas sp.WBC-3对其可代谢芳香烃化合物的趋化
4.2.2 Pseudomonas sp.WBC-3对其非代谢芳香烃化合物的趋化
4.2.3 Pseudomonas sp.WBC-3代谢突变株的趋化特性
4.2.4 Pseudomonas sp.WBC-3对甲基对硫磷的趋化
4.3 讨论
4.3.1 WBC-3对芳香烃化合物的趋化是不依赖于代谢的趋化
4.3.2 WBC-3对芳香烃化合物的趋化属于β-ketoadipate控制的趋化系统
4.3.3 β-ketoadipate趋化系统在土壤微生物中广泛存在
4.3.4 微生物对芳香烃化合物趋化机制的研究进展
4.3.5 WBC-3对甲基对硫磷的趋化
4.3.6 趋化研究方法的进展
第5章 Pseudomonas sp.WBC-3 甲基对硫磷降解性质粒pZWL0的全序列分析
5.1 WBC-3质粒pZWL0的全序列测定及分析
5.2 甲基对硫磷水解酶基因（mph）定位在转座子上
5.2.1 转座子的分类及结构特点
5.2.2 mph转座子的结构特点。
5.3 有机磷水解酶的起源和进化
5.3.1 有机磷水解酶的分类
5.3.2 有机磷水解酶的转座子定位
5.3.3 有机磷水解酶的进化分析
5.3.4 有机磷水解酶的起源与进化历程
5.4 WBC-3质粒pZWL0中与质粒复制、传代有关的基因
5.5 WBC-3质粒pZWL0中与质粒接合转移相关的基因
5.6 WBC-3质粒pZWL0中的其它功能未知基因
5.7 WBC-3质粒pZWL0的基因组织结构特点
5.8 结论
第6章 结论和进一步工作设想
6.1 结论
6.1.1 Pseudomonas sp.WBC-3中4-硝基酚的代谢途径研究
6.1.2 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究
6.1.3 Pseudomonas sp.WBC-3的质粒pZWL0序列分析
6.2 进一步工作设想
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