嗜热类磷酸三酯酶的内酯酶分子进化以提高对有机磷杀虫剂的降解活力
发布时间：2021-07-02 08:47
自二十世纪五十年代以来，有机磷化合物已被广泛地用于农用杀虫剂。由于有机磷化合物能不可逆抑制动物神经系统中的乙酰胆碱酯酶，破坏神经传递，因此对人及家畜等脊椎动物具有极强的毒副作用。由于杀虫剂的过量和连续使用，许多地区土地、水生态系统被有机磷化合物污染，对人类健康构成巨大威胁。目前去除有机磷污染物的方法（漂白处理、碱水解、焚烧或填埋处理等）反应条件剧烈、副产物具有毒性及腐蚀性，限制了广泛应用。微生物来源的磷酸三酯酶（PTE, EC3.1.8.1）可以广泛水解有机磷杀虫剂，具有环保和原位解毒优势，提供了生物修复新途径。由于磷酸三酯酶均来源于常温微生物，较低的生物学稳定性限制了其实际应用。因此，应用生物技术手段，研发生物学稳定性好、广谱、高效的有机磷杀虫剂降解酶势在必行。通过检索细菌基因组数据库，我们发现嗜热细菌Geobacillus kaustophilus HTA426基因组DNA中含有一个磷酸三酯酶（命名为GkaP）编码序列GK1506（GenBank ID:3183579），我们对该基因进行了异源表达，并对重组蛋白的酶学性质、催化机制及分子进化等方面开展了系统研究。重组GkaP具有优异...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 有机磷化合物及其神经毒性
1.2 细菌磷酸三酯酶
1.2.1 底物特异性和立体选择性
1.2.2 X-ray 结构
1.2.3 催化机理
1.2.4 磷酸三酯酶的潜在应用
1.3 磷酸三酯酶的趋异进化
1.4 蛋白质工程简介
1.4.1 蛋白质的理性设计
1.4.1.1 底物特异性与立体选择性的改造
1.4.1.2 活力改造
1.4.1.3 稳定性改造
1.4.1.4 酶分子结构元件嫁接
1.4.2 蛋白质的非理性设计
1.4.2.1 易错 PCR (error-prone PCR)
1.4.2.2 同源基因重组 (homology-dependent gene recombination)
1.4.3 蛋白质的半理性设计
1.4.3.1 特定区域的随机突变
1.4.3.2 随机突变后的定点饱和突变
1.4.3.3 计算机辅助的半理性设计
1.5 分子进化类磷酸三酯的酶内酯酶
1.6 其它有机磷水解酶类
1.6.1 二异丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases)
1.6.2 血清对氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON)
1.6.3 有机磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA)
1.6.4 甲基对硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH)
1.7 立题依据和实验设计
1.8 参考文献
第二章 嗜热磷酸三酯酶基因的克隆、表达及工程菌构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要仪器
2.2.4 培养基
2.2.5 使用的数据库及软件
2.3 实验方法
2.3.1 Geobacillus kaustophilus HTA426 的复苏及培养
2.3.2 G. kaustophilus HTA426 基因组 DNA 的提取
2.3.3 来源于嗜热细菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆
2.3.3.1 引物设计
2.3.3.2 GK1506 基因的 PCR 扩增
2.3.3.3 GK1506 的酶切和纯化
2.3.3.4 pET-28a 载体制备
2.3.3.5 连接产物的转化
2.3.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.3.7 连接产物的转化
2.3.3.8 阳性克隆的筛选及鉴定
2.3.4 GK1506 基因的预表达
2.3.5 GkaP 的分离纯化
2.3.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.4 结果与讨论
2.4.1 同源序列比对及进化关系分析
2.4.2 磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 扩增
2.4.3 重组质粒的构建、转化及阳性克隆的鉴定
2.4.4 目的蛋白的表达和纯化
2.5 小结
2.6 参考文献
第三章 GkaP 的酶学性质
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 酶活力测定方法
3.2.2.1 磷酸三酯酶活力测定方法
3.2.2.2 内酯酶活力测定方法
3.2.2.3 羧酸酯酶活力测定方法
3.2.3 最适温度和热稳定性测定
3.2.4 最适 pH 和 pH 稳定性测定
3.2.5 动力学常数的测定
3.2.6 不同的二价金属离子取代对酶活性的影响
3.2.7 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响
3.2.8 蛋白的金属含量测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 GkaP 的最适温度和热稳定性
3.3.2 GkaP 的最适 pH 和 pH 稳定性
3.3.3 GkaP 的催化“非专一性”
3.3.4 不同的二价离子构建的 GkaP 对酶活力的影响
3.3.5 GkaP 的金属含量分析
3.3.6 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响
3.4 小结
3.5 参考文献
第四章 GkaP 活性中心附近热点氨基酸的突变体设计与功能研究
4.1 引言
4.2 实验方法
4.2.1 同源序列比对
4.2.2 定点突变和定点饱和突变
4.2.3 饱和突变库的筛选
4.2.4 野生型 GkaP 及其突变体的表达、纯化
4.2.5 动力学常数测定
4.2.6 野生型 GkaP 及其突变体对各种杀虫剂的比活力测定
4.2.7 底物的分子对接
4.3 结果与讨论
4.3.1 GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位点饱和突变库的构建和筛选
4.3.2 突变体的动力学常数分析
4.3.3 突变体对于几种有机磷杀虫剂的比活力
4.3.4 GkaP 突变体活力变化的结构基础
4.4 小结
4.5 参考文献
第五章 GkaP 的分子进化—提高对有机磷杀虫剂的降解活力
5.1 引言
5.2 实验方法
5.2.1 定点突变和定点饱和突变
5.2.2 全基因易错 PCR 突变库的构建
5.2.3 突变库筛选
5.2.4 突变体的表达和纯化
5.2.5 动力学常数和各种杀虫剂比活力测定方法
5.2.6 突变体的热稳定性、最适温度和 pH 测定
5.2.7 突变体的同源建模
5.3 结果与讨论
5.3.1 GkaP 的进化策略
5.3.2 突变体的动力学常数分析
5.3.3 突变体的热稳定性分析
5.3.4 突变体的生化性质表征 (最适温度和最适 pH)
5.3.5 突变体对不同有机磷杀虫剂的比活力
5.3.6 突变位点的结构分析
5.4 小结
5.5 参考文献
创新点
展望
作者简历
攻读博士期间发表成果
参与的科研课题
致谢
本文编号：3260145
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 有机磷化合物及其神经毒性
1.2 细菌磷酸三酯酶
1.2.1 底物特异性和立体选择性
1.2.2 X-ray 结构
1.2.3 催化机理
1.2.4 磷酸三酯酶的潜在应用
1.3 磷酸三酯酶的趋异进化
1.4 蛋白质工程简介
1.4.1 蛋白质的理性设计
1.4.1.1 底物特异性与立体选择性的改造
1.4.1.2 活力改造
1.4.1.3 稳定性改造
1.4.1.4 酶分子结构元件嫁接
1.4.2 蛋白质的非理性设计
1.4.2.1 易错 PCR (error-prone PCR)
1.4.2.2 同源基因重组 (homology-dependent gene recombination)
1.4.3 蛋白质的半理性设计
1.4.3.1 特定区域的随机突变
1.4.3.2 随机突变后的定点饱和突变
1.4.3.3 计算机辅助的半理性设计
1.5 分子进化类磷酸三酯的酶内酯酶
1.6 其它有机磷水解酶类
1.6.1 二异丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases)
1.6.2 血清对氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON)
1.6.3 有机磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA)
1.6.4 甲基对硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH)
1.7 立题依据和实验设计
1.8 参考文献
第二章 嗜热磷酸三酯酶基因的克隆、表达及工程菌构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要仪器
2.2.4 培养基
2.2.5 使用的数据库及软件
2.3 实验方法
2.3.1 Geobacillus kaustophilus HTA426 的复苏及培养
2.3.2 G. kaustophilus HTA426 基因组 DNA 的提取
2.3.3 来源于嗜热细菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆
2.3.3.1 引物设计
2.3.3.2 GK1506 基因的 PCR 扩增
2.3.3.3 GK1506 的酶切和纯化
2.3.3.4 pET-28a 载体制备
2.3.3.5 连接产物的转化
2.3.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.3.7 连接产物的转化
2.3.3.8 阳性克隆的筛选及鉴定
2.3.4 GK1506 基因的预表达
2.3.5 GkaP 的分离纯化
2.3.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.4 结果与讨论
2.4.1 同源序列比对及进化关系分析
2.4.2 磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 扩增
2.4.3 重组质粒的构建、转化及阳性克隆的鉴定
2.4.4 目的蛋白的表达和纯化
2.5 小结
2.6 参考文献
第三章 GkaP 的酶学性质
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 酶活力测定方法
3.2.2.1 磷酸三酯酶活力测定方法
3.2.2.2 内酯酶活力测定方法
3.2.2.3 羧酸酯酶活力测定方法
3.2.3 最适温度和热稳定性测定
3.2.4 最适 pH 和 pH 稳定性测定
3.2.5 动力学常数的测定
3.2.6 不同的二价金属离子取代对酶活性的影响
3.2.7 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响
3.2.8 蛋白的金属含量测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 GkaP 的最适温度和热稳定性
3.3.2 GkaP 的最适 pH 和 pH 稳定性
3.3.3 GkaP 的催化“非专一性”
3.3.4 不同的二价离子构建的 GkaP 对酶活力的影响
3.3.5 GkaP 的金属含量分析
3.3.6 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响
3.4 小结
3.5 参考文献
第四章 GkaP 活性中心附近热点氨基酸的突变体设计与功能研究
4.1 引言
4.2 实验方法
4.2.1 同源序列比对
4.2.2 定点突变和定点饱和突变
4.2.3 饱和突变库的筛选
4.2.4 野生型 GkaP 及其突变体的表达、纯化
4.2.5 动力学常数测定
4.2.6 野生型 GkaP 及其突变体对各种杀虫剂的比活力测定
4.2.7 底物的分子对接
4.3 结果与讨论
4.3.1 GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位点饱和突变库的构建和筛选
4.3.2 突变体的动力学常数分析
4.3.3 突变体对于几种有机磷杀虫剂的比活力
4.3.4 GkaP 突变体活力变化的结构基础
4.4 小结
4.5 参考文献
第五章 GkaP 的分子进化—提高对有机磷杀虫剂的降解活力
5.1 引言
5.2 实验方法
5.2.1 定点突变和定点饱和突变
5.2.2 全基因易错 PCR 突变库的构建
5.2.3 突变库筛选
5.2.4 突变体的表达和纯化
5.2.5 动力学常数和各种杀虫剂比活力测定方法
5.2.6 突变体的热稳定性、最适温度和 pH 测定
5.2.7 突变体的同源建模
5.3 结果与讨论
5.3.1 GkaP 的进化策略
5.3.2 突变体的动力学常数分析
5.3.3 突变体的热稳定性分析
5.3.4 突变体的生化性质表征 (最适温度和最适 pH)
5.3.5 突变体对不同有机磷杀虫剂的比活力
5.3.6 突变位点的结构分析
5.4 小结
5.5 参考文献
创新点
展望
作者简历
攻读博士期间发表成果
参与的科研课题
致谢
本文编号：3260145
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