Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及功能基因筛选
发布时间：2022-01-14 07:34
Dietzia属菌具有很好的烃类降解和良好的高盐、高碱耐受能力.为研究Dietzia属降解烷烃和耐受盐碱的分子机制,以Dietzia sp. DQ12-45-1b为研究菌株,利用双质粒系统p Tip-istAB-sacB和pRTSK-sacB,成功构建库容为30 720的随机突变体文库.随机挑选的突变克隆及突变克隆传代20次后的Southern blot结果表明:转座序列插入的随机性较好,均为单插入突变,并且具有较好的遗传稳定性,可用于长期筛选功能基因.在此基础上,分别以高盐培养和正十六烷为单一碳源培养,利用高通量基因筛选,成功获得了一个耐盐突变体M9G和5个降解利用正十六烷相关突变株M6A、M6B、M7A、M9A、M81C.与野生型相比,5个降解利用正十六烷相关突变株的降解率下降范围为16.67%-84.35%.插入位点分析结果显示,M9G、M6A、M6B、M7A、M9A和M81C的插入基因分别预测为丝氨酸蛋白酶、铁氧化还原蛋白、假定蛋白、铁氧化还原蛋白还原酶、ABC转运蛋白和细胞色素P450类CYP153烷烃羟化酶.其中除了预测假定蛋白外,有些基因与传统上确定的功能存在差异,暗示着...
【文章来源】：应用与环境生物学报. 2020,26(04)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
DQ12-45-1b突变株基因组中转座子PCR扩增.1-9:DQ12-45-1b突变体库随机挑选的9株突变株；10:pRTSK-sacB;11:DQ12-45-1b（野生型菌株）；M:DNA maker(DL 5000).
为验证DQ12-45-1b随机突变体文库的构建质量，我们主要考察了插入随机性、插入拷贝数和传代稳定性.为验证插入的随机性和单一性，随机挑选了9个突变株克隆经Bam H I酶切后，进行Southern blot杂交检测.结果（图2）表明，各突变株得到的杂交条带大小不一，说明了转座序列插入到了不同的位点，证明转座插入的随机性较好；同时各泳道均只有一条单一条带，表明9个突变体均为单一位点插入突变，突变体插入拷贝数为1的概率较高（图2A）.为验证突变体的传代稳定性，随机挑选的9个突变株传代20次后，再次进行Southern blot杂交试验，结果显示转座序列插入基因组后不会丢失，可用于长期筛选功能基因，表明该突变文库具有较好的遗传稳定性（图2B).2.3 耐盐基因的筛选和鉴定
以野生型DQ12-45-1b菌株为平行对照，将M9G突变株分别接种于不含NaCl的正常GPY液体培养基和含100 g/L NaCl的高盐GPY液体培养基中进行培养，观察期生长情况.结果表明：在正常GPY培养基中，M9G与野生型菌株生长状态没有显著差异；但在高盐GPY培养基中，M9G的生长情况显著弱于野生型菌株（图3），证明了M9G中与其耐盐相关基因被插入失活.提取M9G突变株全基因组DNA，通过酶切、自环化后转入大肠杆菌DH5α中，提取质粒，测序，进行转座子插入位点鉴定.结果表明：在M9G中，转座子插入位点在Contig46-orf03606的-239 bp处.通过KEGG和SWISS等数据库注释，Contig46-orf03606编码丝氨酸蛋白酶（Serine protease）；通过与NCBI数据库比对分析，发现Contig46-orf03606与Dietzia sp.UCD-THP中编码Do/DeqQ家族丝氨酸蛋白酶基因序列具有最高的相似性，达到99%.系统发育分析也表明Contig46-orf03606与Dietzia菌的相关序列聚为一簇（图4A).Do/DeqQ家族的丝氨酸蛋白酶位于胞内，具有蛋白酶和分子伴侣的双重功能.在正常温度下，其行驶分子伴侣的功能，帮助蛋白正确折叠.在高温状态下，其主要功能是帮助水解错误折叠的蛋白分子[26].但以前还没有关于丝氨酸蛋白酶与耐盐相关的报道.有研究表明，在高盐条件下，细胞内通常会发生蛋白失活和聚集、以及蛋白合成速率降低[27]，这需要丝氨酸蛋白酶来发挥维持正常折叠和合成过程的功能，保证细胞进行正常的生命活动过程.为此，我们推测Contig46-orf03606编码的丝氨酸蛋白酶失活，将无法维持在盐胁迫下细胞内功能蛋白的正常折叠和合成过程，无法保证细胞内合成更多的功能蛋白，使其能够快速调节细胞的渗透平衡，从而获得较强的耐盐胁迫能力.
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌Dietzia sp.DQ12-45-1b中两种长链烷烃羟化酶基因的鉴定[J]. 马冬玲,聂勇,吴晓磊,刘立明. 应用与环境生物学报. 2015(05)
[2]水稻插入突变库构建研究进展[J]. 阎双勇,谭振波,李仕贵. 中国生物工程杂志. 2004(06)
本文编号：3588095
【文章来源】：应用与环境生物学报. 2020,26(04)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
DQ12-45-1b突变株基因组中转座子PCR扩增.1-9:DQ12-45-1b突变体库随机挑选的9株突变株；10:pRTSK-sacB;11:DQ12-45-1b（野生型菌株）；M:DNA maker(DL 5000).
为验证DQ12-45-1b随机突变体文库的构建质量，我们主要考察了插入随机性、插入拷贝数和传代稳定性.为验证插入的随机性和单一性，随机挑选了9个突变株克隆经Bam H I酶切后，进行Southern blot杂交检测.结果（图2）表明，各突变株得到的杂交条带大小不一，说明了转座序列插入到了不同的位点，证明转座插入的随机性较好；同时各泳道均只有一条单一条带，表明9个突变体均为单一位点插入突变，突变体插入拷贝数为1的概率较高（图2A）.为验证突变体的传代稳定性，随机挑选的9个突变株传代20次后，再次进行Southern blot杂交试验，结果显示转座序列插入基因组后不会丢失，可用于长期筛选功能基因，表明该突变文库具有较好的遗传稳定性（图2B).2.3 耐盐基因的筛选和鉴定
以野生型DQ12-45-1b菌株为平行对照，将M9G突变株分别接种于不含NaCl的正常GPY液体培养基和含100 g/L NaCl的高盐GPY液体培养基中进行培养，观察期生长情况.结果表明：在正常GPY培养基中，M9G与野生型菌株生长状态没有显著差异；但在高盐GPY培养基中，M9G的生长情况显著弱于野生型菌株（图3），证明了M9G中与其耐盐相关基因被插入失活.提取M9G突变株全基因组DNA，通过酶切、自环化后转入大肠杆菌DH5α中，提取质粒，测序，进行转座子插入位点鉴定.结果表明：在M9G中，转座子插入位点在Contig46-orf03606的-239 bp处.通过KEGG和SWISS等数据库注释，Contig46-orf03606编码丝氨酸蛋白酶（Serine protease）；通过与NCBI数据库比对分析，发现Contig46-orf03606与Dietzia sp.UCD-THP中编码Do/DeqQ家族丝氨酸蛋白酶基因序列具有最高的相似性，达到99%.系统发育分析也表明Contig46-orf03606与Dietzia菌的相关序列聚为一簇（图4A).Do/DeqQ家族的丝氨酸蛋白酶位于胞内，具有蛋白酶和分子伴侣的双重功能.在正常温度下，其行驶分子伴侣的功能，帮助蛋白正确折叠.在高温状态下，其主要功能是帮助水解错误折叠的蛋白分子[26].但以前还没有关于丝氨酸蛋白酶与耐盐相关的报道.有研究表明，在高盐条件下，细胞内通常会发生蛋白失活和聚集、以及蛋白合成速率降低[27]，这需要丝氨酸蛋白酶来发挥维持正常折叠和合成过程的功能，保证细胞进行正常的生命活动过程.为此，我们推测Contig46-orf03606编码的丝氨酸蛋白酶失活，将无法维持在盐胁迫下细胞内功能蛋白的正常折叠和合成过程，无法保证细胞内合成更多的功能蛋白，使其能够快速调节细胞的渗透平衡，从而获得较强的耐盐胁迫能力.
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌Dietzia sp.DQ12-45-1b中两种长链烷烃羟化酶基因的鉴定[J]. 马冬玲,聂勇,吴晓磊,刘立明. 应用与环境生物学报. 2015(05)
[2]水稻插入突变库构建研究进展[J]. 阎双勇,谭振波,李仕贵. 中国生物工程杂志. 2004(06)
本文编号：3588095
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