木霉菌REMI突变株耐受Cd机理及其对油菜富集Cd影响
发布时间：2022-06-03 21:47
多年来农田土壤重金属污染是我国农产品安全生产的主要威胁，因此研究生物修复农业土壤关键技术具有重要意义。木霉菌是广泛分布于植物根围的有益微生物，除具有防治土传植物病害的作用外，还发现可与植物形成共生体（symbiont）联合修复农化物质对环境的污染，具有修复土壤重金属污染的潜在价值。因此揭示木霉菌耐受重金属和与修复性植物互作的机理是构建木霉菌-植物联合修复农业土壤环境的技术基础。本研究是通过限制性内切酶介导整合（Restriction enzyme mediated integration,REMI）技术构建并筛选获得耐受Cd的木霉菌突变株，研究突变株耐受Cd及其对甘蓝型油菜富集Cd的影响，主要结果如下：以康氏木霉（Trichoderma koningii）T30为出发菌，利用REMI技术检构建了200株突变株，筛选获得10株耐受Cd突变株，与野生株（T30）相比，突变株平均耐受Cd的IC50值增加1.5~2倍。去Cd率达到23~39%，提高3~4倍。其中，突变株P6是最理想的突变株。REMI诱变技术提高了木霉菌对Cd引起的氧化胁迫效应的耐性水平。在Cd胁迫下，P6的MDA峰值小于T30...
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 重金属镉污染土壤的生物修复
1.1 重金属镉对农田的污染
1.2 植物修复
1.3 微生物修复
1.4 微生物-植物联合修复
1.4.1 菌根菌-植物联合修复
1.4.2 根际细菌-植物联合修复
1.4.3 木霉-植物联合修复
1.5 耐受重金属 Cd 的微生物获得
2 真菌耐受重金属镉胁迫的机理
2.1 胞外络合、沉淀
2.2 细胞壁结合
2.3 跨膜转运
2.4 胞内脱毒
2.4.1 隔离
2.4.2 螯合
2.5 抗氧化作用
3 展望
4 本研究的意义和主要研究内容
第二章 木霉菌 REMI 突变株构建与耐受 Cd 突变株筛选
1 材料与方法
1.1 原生质体制备
1.2 转化
1.3 分子检测
1.4 突变株筛选
1.4.1 初筛
1.4.2 复筛
2 结果与分析
2.1 REMI 突变株构建
2.2 突变株初筛
2.3 复筛
3 结论与讨论
第三章 木霉菌 REMI 突变株耐受 Cd 的生理生化分析
1 材料与方法
1.1 Cd 对 P6 菌丝胁迫的氧化反应测定
1.1.1 粗酶提取液制备
1.1.2 MDA 检测
1.1.3 O_2~-检测
1.1.4 GSH 测定
1.1.5 CAT 活性的测定
1.1.6 SOD 活性的测定
1.2 富集 Cd 亚细胞定位及吸附基团鉴定
1.2.1 Cd 亚细胞定位的超微观察
1.2.2 细胞吸附 Cd 的生化基团鉴定
1.3 影响吸附 Cd~(2+)的因素分析
1.4 统计分析
2 结果与分析
2.1 Cd 对木霉菌的氧化胁迫作用
2.2 抗氧化胁迫作用
2.3 富集 Cd 亚细胞定位及吸附基团鉴定
2.3.1 突变株富集 Cd 亚细胞定位
2.3.2 细胞壁吸附 Cd 的相关基团
2.4 吸附动力学
2.5 影响突变株吸附 Cd 的因素分析
3 结论与讨论
3.1 突变株 P6 具有较强耐受 Cd 所致氧化胁迫能力
3.2 明确了突变株 P6 菌丝吸附 Cd 位点
3.3 环境 pH 是影响 P6 吸附 Cd 效率的关键因子
第四章 REMI 突变株插入位点侧翼基因克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 质粒抢救
1.2 tkpah 基因克隆
1.3 生物信息学分析
1.4 tkpah 表达特征
1.5 tkpah 的 GFP 标记定位
1.6 tkpah 基因拷贝数分析
1.7 Tkpah 原核表达、纯化和酶活检测
2 结果与分析
2.1 质粒抢救
2.2 tkpah 基因克隆
2.3 tkpah 推断氨基酸序列分析
2.4 tkpah 系统进化树
2.5 Tkpah 蛋白原核表达和纯化
2.6 酶活检测
2.7 tpah 基因表达分析
2.8 tkpah 的 GFP 定位
3 结论与讨论
3.1 成功构建了木霉菌 REMI 突变株质粒抢救技术体系
3.2 tkpah 是细胞质 GVIIPLA2基因同源物
3.3 tkpah 表达具有组织特异性
第五章 tkpah 基因功能分析
1 材料与方法
1.2 tkpah 的构建
1.2.1 敲除载体构建
1.2.2 转化、筛选和验证
1.2.3 敲除子菌落形态、生长分析
1.2.4 敲除子重金属 Cd 和 H_2O_2的耐受力检测
1.2.5 敲除子对重金属 Cd 的吸附
2 结果
2.1 tkpah 构建
2.2 敲除子菌落形态和生长分析
2.3 敲除子对 Cd 和 H2O2胁迫的耐受性分析
2.4 敲除子吸附 Cd 的特性
3 结论与讨论
3.1 tkpah 可能以负调控方式控制木霉菌对 Cd 的耐受性
3.2 木霉菌存在多重吸附 Cd 的机理
第六章 REMI 突变株应答 Cd 胁迫蛋白质组分析
1 材料与方法
1.1 Cd 处理的 P6 菌丝蛋白样品制备
1.2 双向电泳
1.2.1 水化
1.2.2 等电聚焦
1.2.3 平衡
1.2.4 二向电泳
1.3 图像采集、质谱鉴定
2 结果与分析
2.1 Cd 胁迫下的 P6 菌丝体蛋白质组变化
2.2 差异蛋白质谱鉴定
3 结论与讨论
3.1 双向电泳是研究木霉菌耐 Cd 胁迫机理的有效手段
3.2 Cd 胁迫可明显影响木霉 REMI 突变株抗逆相关蛋白表达
第七章 REMI 突变株对油菜富集 Cd 的影响
1 材料与方法
1.1 土壤处理
1.2 盆栽试验
1.3 油菜生物量测定
1.4 油菜组织内的 Cd 浓度测定
1.5 数据分析
2 结果与分析
2.1 P6 对油菜生长和耐 Cd 的影响
2.2 P6 促进油菜地上部组织富集 Cd
2.3 P6 增加了油菜对土壤 Cd 污染的净化率
3 结论与讨论
3.1 木霉菌突变株提高了油菜富集 Cd 的能力
3.2 土壤 Cd 浓度影响油菜对 Cd 的吸附效果
第八章 全文总结和后续研究展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]木霉菌及其REMI突变株与油菜联合吸附镉污染土壤研究[J]. 高永东,王兵,刘力行,陈捷,周熙荣. 现代农业科技. 2008(20)
[2]棉花6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位[J]. 贺亚军,郭旺珍,张天真. 作物学报. 2008(09)
[3]抑制稗草生长的木霉菌REMI转化子构建与功能初探[J]. 李薇,王兵,陈云鹏,刘力行,徐书法,陈捷. 安徽农业科学. 2007(21)
[4]外生菌根真菌对油松幼苗根际土壤重金属赋存的影响[J]. 黄艺,李婷,费颖恒. 生态与农村环境学报. 2007(03)
[5]木霉拮抗黄瓜枯萎病菌菌株的筛选[J]. 曹玉桃,姚革,文成敬,刘波微,席亚东,彭化贤. 西南农业学报. 2007(03)
[6]酿酒酵母吸附Zn2+和Cd2+的动力学[J]. 郜瑞莹,陈灿,王建龙. 清华大学学报(自然科学版). 2007(06)
[7]去除污泥中重金属的研究进展[J]. 和苗苗,田光明,梁新强. 农机化研究. 2007(05)
[8]珠海市蔬菜重金属污染的调查研究[J]. 胡小玲,张瑰,陈剑刚,刘宏江,王丽玲. 中国卫生检验杂志. 2006(08)
[9]木霉（Trichoderma sp.）HR-1活细胞吸附Pb（Ⅱ）的机理[J]. 沈薇,杨树林,李校堃,袁辉,高力虎. 中国环境科学. 2006(01)
[10]接种AM真菌对黑麦草吸收和分配Cd的影响[J]. 冯海艳,刘茵,冯固,李晓林. 农业环境科学学报. 2005(03)
博士论文
[1]丛枝菌根减轻宿主植物锌、镉毒害机理研究[D]. 陈保冬.中国农业大学 2002
本文编号：3653539
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 重金属镉污染土壤的生物修复
1.1 重金属镉对农田的污染
1.2 植物修复
1.3 微生物修复
1.4 微生物-植物联合修复
1.4.1 菌根菌-植物联合修复
1.4.2 根际细菌-植物联合修复
1.4.3 木霉-植物联合修复
1.5 耐受重金属 Cd 的微生物获得
2 真菌耐受重金属镉胁迫的机理
2.1 胞外络合、沉淀
2.2 细胞壁结合
2.3 跨膜转运
2.4 胞内脱毒
2.4.1 隔离
2.4.2 螯合
2.5 抗氧化作用
3 展望
4 本研究的意义和主要研究内容
第二章 木霉菌 REMI 突变株构建与耐受 Cd 突变株筛选
1 材料与方法
1.1 原生质体制备
1.2 转化
1.3 分子检测
1.4 突变株筛选
1.4.1 初筛
1.4.2 复筛
2 结果与分析
2.1 REMI 突变株构建
2.2 突变株初筛
2.3 复筛
3 结论与讨论
第三章 木霉菌 REMI 突变株耐受 Cd 的生理生化分析
1 材料与方法
1.1 Cd 对 P6 菌丝胁迫的氧化反应测定
1.1.1 粗酶提取液制备
1.1.2 MDA 检测
1.1.3 O_2~-检测
1.1.4 GSH 测定
1.1.5 CAT 活性的测定
1.1.6 SOD 活性的测定
1.2 富集 Cd 亚细胞定位及吸附基团鉴定
1.2.1 Cd 亚细胞定位的超微观察
1.2.2 细胞吸附 Cd 的生化基团鉴定
1.3 影响吸附 Cd~(2+)的因素分析
1.4 统计分析
2 结果与分析
2.1 Cd 对木霉菌的氧化胁迫作用
2.2 抗氧化胁迫作用
2.3 富集 Cd 亚细胞定位及吸附基团鉴定
2.3.1 突变株富集 Cd 亚细胞定位
2.3.2 细胞壁吸附 Cd 的相关基团
2.4 吸附动力学
2.5 影响突变株吸附 Cd 的因素分析
3 结论与讨论
3.1 突变株 P6 具有较强耐受 Cd 所致氧化胁迫能力
3.2 明确了突变株 P6 菌丝吸附 Cd 位点
3.3 环境 pH 是影响 P6 吸附 Cd 效率的关键因子
第四章 REMI 突变株插入位点侧翼基因克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 质粒抢救
1.2 tkpah 基因克隆
1.3 生物信息学分析
1.4 tkpah 表达特征
1.5 tkpah 的 GFP 标记定位
1.6 tkpah 基因拷贝数分析
1.7 Tkpah 原核表达、纯化和酶活检测
2 结果与分析
2.1 质粒抢救
2.2 tkpah 基因克隆
2.3 tkpah 推断氨基酸序列分析
2.4 tkpah 系统进化树
2.5 Tkpah 蛋白原核表达和纯化
2.6 酶活检测
2.7 tpah 基因表达分析
2.8 tkpah 的 GFP 定位
3 结论与讨论
3.1 成功构建了木霉菌 REMI 突变株质粒抢救技术体系
3.2 tkpah 是细胞质 GVIIPLA2基因同源物
3.3 tkpah 表达具有组织特异性
第五章 tkpah 基因功能分析
1 材料与方法
1.2 tkpah 的构建
1.2.1 敲除载体构建
1.2.2 转化、筛选和验证
1.2.3 敲除子菌落形态、生长分析
1.2.4 敲除子重金属 Cd 和 H_2O_2的耐受力检测
1.2.5 敲除子对重金属 Cd 的吸附
2 结果
2.1 tkpah 构建
2.2 敲除子菌落形态和生长分析
2.3 敲除子对 Cd 和 H2O2胁迫的耐受性分析
2.4 敲除子吸附 Cd 的特性
3 结论与讨论
3.1 tkpah 可能以负调控方式控制木霉菌对 Cd 的耐受性
3.2 木霉菌存在多重吸附 Cd 的机理
第六章 REMI 突变株应答 Cd 胁迫蛋白质组分析
1 材料与方法
1.1 Cd 处理的 P6 菌丝蛋白样品制备
1.2 双向电泳
1.2.1 水化
1.2.2 等电聚焦
1.2.3 平衡
1.2.4 二向电泳
1.3 图像采集、质谱鉴定
2 结果与分析
2.1 Cd 胁迫下的 P6 菌丝体蛋白质组变化
2.2 差异蛋白质谱鉴定
3 结论与讨论
3.1 双向电泳是研究木霉菌耐 Cd 胁迫机理的有效手段
3.2 Cd 胁迫可明显影响木霉 REMI 突变株抗逆相关蛋白表达
第七章 REMI 突变株对油菜富集 Cd 的影响
1 材料与方法
1.1 土壤处理
1.2 盆栽试验
1.3 油菜生物量测定
1.4 油菜组织内的 Cd 浓度测定
1.5 数据分析
2 结果与分析
2.1 P6 对油菜生长和耐 Cd 的影响
2.2 P6 促进油菜地上部组织富集 Cd
2.3 P6 增加了油菜对土壤 Cd 污染的净化率
3 结论与讨论
3.1 木霉菌突变株提高了油菜富集 Cd 的能力
3.2 土壤 Cd 浓度影响油菜对 Cd 的吸附效果
第八章 全文总结和后续研究展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]木霉菌及其REMI突变株与油菜联合吸附镉污染土壤研究[J]. 高永东,王兵,刘力行,陈捷,周熙荣. 现代农业科技. 2008(20)
[2]棉花6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位[J]. 贺亚军,郭旺珍,张天真. 作物学报. 2008(09)
[3]抑制稗草生长的木霉菌REMI转化子构建与功能初探[J]. 李薇,王兵,陈云鹏,刘力行,徐书法,陈捷. 安徽农业科学. 2007(21)
[4]外生菌根真菌对油松幼苗根际土壤重金属赋存的影响[J]. 黄艺,李婷,费颖恒. 生态与农村环境学报. 2007(03)
[5]木霉拮抗黄瓜枯萎病菌菌株的筛选[J]. 曹玉桃,姚革,文成敬,刘波微,席亚东,彭化贤. 西南农业学报. 2007(03)
[6]酿酒酵母吸附Zn2+和Cd2+的动力学[J]. 郜瑞莹,陈灿,王建龙. 清华大学学报(自然科学版). 2007(06)
[7]去除污泥中重金属的研究进展[J]. 和苗苗,田光明,梁新强. 农机化研究. 2007(05)
[8]珠海市蔬菜重金属污染的调查研究[J]. 胡小玲,张瑰,陈剑刚,刘宏江,王丽玲. 中国卫生检验杂志. 2006(08)
[9]木霉（Trichoderma sp.）HR-1活细胞吸附Pb（Ⅱ）的机理[J]. 沈薇,杨树林,李校堃,袁辉,高力虎. 中国环境科学. 2006(01)
[10]接种AM真菌对黑麦草吸收和分配Cd的影响[J]. 冯海艳,刘茵,冯固,李晓林. 农业环境科学学报. 2005(03)
博士论文
[1]丛枝菌根减轻宿主植物锌、镉毒害机理研究[D]. 陈保冬.中国农业大学 2002
本文编号：3653539
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