脱氨酶AmnE的表达纯化及其结构解析

发布时间：2025-03-30 00:45

　　微生物在污染环境的生物修复方面具有重要作用,它们对环境污染物的降解是通过一系列酶来进行的。因此,研究污染物降解过程中关健酶的作用机理,对于阐明微生物对污染物的生物降解过程以及生物修复机制具有重要意义。蛋白质晶体学是利用X射线衍射技术对蛋白质的结构进行解析的一门学科,它能使我们从原子角度了解蛋白质的结构信息,结合蛋白质的功能特性,可以确定在实际催化过程中的功能基团及其作用方式,为定向改造提供重要信息。硝基苯是一种重要的化工原料和化学中间体,进入环境的硝基苯会长期残留在水体和土壤里,对人类健康造成严重的危害。本文以硝基苯代谢途径中的脱氨酶AmnE作为研究对象,利用Ni-NTA亲和层析及Resource Q离子交换层析对重组表达于大肠杆菌BL21 (DE3)中的AmnE蛋白进行纯化。利用悬滴气相扩散法和商业结晶试剂盒进行结晶条件的筛选和优化,并在0.2 M KCl、23% PEG3350、0.2 M Bis-Tris pH 7.5的结晶条件下获得了高分辨率的蛋白晶体。AmnE晶体的分辨率为2.09A,属于正交晶系,空间群为C2221,晶胞参数为a= 63.23 A、b= 88.93 A、c= ...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－７蜜白质结晶过程示意图??Ｋ．?１－７?Ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆｒｏ化ｉｎ?ｃｒｓ化ｌｌｉｚａｔｉｏｎ??

的单晶的获得是蛋白质晶体结构解析的前提。蛋白质结晶过程是一个有序化的过程，??即在溶液中处于随机状态的分子转变成有序聚集的状态。当溶液达到过饱和状态时，??蛋白质牙可能开始结晶，如图１－７。晶体生长包括晶核形成（包含１０至２００个分子的??聚集）和晶体长大（周围的分子向晶核聚集）....

图１－８晶体Ｘ射线巧射不意图??

?使用接收器如ＣＣＤ记录Ｘ射线散射的强度，Ｗ获得与与晶体内部的原子分布规律相??对应的特有的衍射图谱，如图１－８。在衍射数据收集时，一般先收集几幅衍射图谱检??查晶体的衍射质量，如果出现衍射点弱、分辨率低、李晶等现象，就没有必要继续收??集数据。如果衍射质量不错，则进行指标化处理....

图２－１蛋白质的结晶方法??

初筛得到的晶体往往是微晶、奕晶或者衍射效果较差的晶体，所Ｗ需要对其初筛??的条件开展进一步的优化工作。??Ｕ）采用悬滴气相扩散法（如图２－１）进行结晶条件的优化具体操作步骤如下；??２６??

图３－１?ＰＣ艮扩增产物??Ｆｉｇ．?３－１?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＡｍｎＥ??

３．２．１?ＰＣ艮扩增??Ｗ公司合成的ａｍｎＥ基因作为模板，应用设计的特异性引物（如表２－３），进行??．Ｋ：民扩増，其产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图３－１。??Ｍ?１?■??６０００?ｂｐ－＾１??１０００?ｂｐ?－？接造皆?Ｉ??图３－１?ＰＣ艮扩增产物??Ｆｉｇ．?....

本文编号：4037916