MicroRNA-29与小鼠性发育调控相关的功能研究

发布时间：2018-02-03 08:45

本文关键词： MicroRNA 过表达动物模型慢病毒性发育相关基因靶基因　出处：《东华大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:Micro RNAs(miRNAs)是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,长约21~25个核苷酸,能通过靶向结合并断裂目的m RNA或抑制m RNA的蛋白质翻译来调控生物学的进程。据报道人类所有的背景:Micro RNAs(miRNAs)是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,长约21~25个核苷酸,能通过靶向结合并断裂目的m RNA或抑制m RNA的蛋白质翻译来调控生物学的进程。据报道人类所有的miRNA约占基因总数的3%,可能调控人体细胞中约30%的蛋白质编码基因。本实验之前所作的小鼠脑组织中的基因芯片数据显示在小鼠性发育过程中miR-29b的表达中出现了显著变化,此外取不同生长周期的小鼠下丘脑的组织进行检测,发现miR-29b的表达量也出现明显差异,表明miR-29b可能在哺乳动物神经系统中发挥重要作用从而调控个体的生长发育,推断是一种与性发育相关的micro RNA。目的:在小鼠下丘脑来源的细胞GT1-7中,构建miR-29b稳转株,检测过表达后对靶基因,性发育相关基因的影响;转染micro RNA-29mimics,探究来自同一家族成员miR-29a和miR-29b之间的协同调控作用;利用下丘脑原位注射构建miR-29b过表达小鼠模型,通过小鼠的性发育相关表型观测,探索miR-29b与性发育调控之间的关系。方法:构建miR-29a和miR-29b的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒转染GT1-7细胞中,利用博来霉素筛选14天后,获得稳转株,通过荧光定量PCR进行miR-29表达量检测,以确定稳转株是否可以作为miR-29过表达细胞模型加以应用;将miR-29a mimic,miR-29b mimic分别转染到GT1-7细胞,通过荧光定量PCR检测二者之间是否存在相互作用,并通过性发育相关基因表达量分析,研究miR-29的生物学功能;通过下丘脑定位注射的方式,将miR-29b慢病毒颗粒注射到出生12天的雌性C57/B6小鼠的下丘脑中,观察和记录miR-29b下丘脑过表达小鼠的体重增长、阴门开启时间、合笼到生育时长、子鼠出生数量、子鼠死亡率等性发育表型,以确定miR-29是否参与了小鼠性发育启动的调控。结果:在细胞实验方面,过表达miR-29b的GT1-7细胞稳转株中,miR-29b的表达量上升大约28倍,同时3种靶基因(DCX,Vdac1,Pten)的表达量都出现了不同程度的下降,DCX表达量下降了44%左右,Vdac1表达量下降了16%左右,Pten表达量下降了17%左右,LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,leptin-R等7个与性发育相关的基因表达量水平没有明显变化;探究来自同一家族两种micro RNA之间的相互作用,转染miR-29a mimic后,结果表明miR-29a的表达量显著提高,增加了91倍左右,然而miR-29b的表达量没有显著的变化,同时检测与性发育相关的几个基因,发现只有Leptin-R表达水平下降了9.5%,同样在转染miR-29b mimic后,miR-29b的表达量也显著上升,提高105倍左右,然而miR-29a也没有太大变化。检测与性发育相关的几种基因,Leptin-R表达水平下降了10.2%。表明miR-29a,miR-29b虽然来自相同的家族,有着相同的种子序列,但它们之间不会有一种miRNA高表达之后对另一种miRNA产生影响;在动物实验方面,注射小鼠下丘脑中miR-29b的表达量明显上升,表明利用该方法成功构建miR-29b在下丘脑中过表达的小鼠模型。检测与性发育相关基因时,发现kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,LH-β在三组中没有变化,Leptin-R的表达量在慢病毒组中显著下降。与对照组相比,miR-29b慢病毒注射小鼠的平均体重轻了2g左右,且体重增长缓慢,阴门开启时间为35.38±0.9161(天),推迟了2天,与雄鼠合笼后,从合笼到子鼠出生时间平均为25.33±0.8165(天),推迟了2天,出生子鼠的数量为6.167±0.167(只)较对照组会减少1只,子鼠出生后,慢病毒注射组相比对照组出现了高的死亡比例,慢病毒死亡数为1.500±0.224(只),每窝子鼠死亡数量达到1.5只。结论:在细胞实验方面,利用慢病毒成功构建了过表达miR-29b的GT1-7细胞的稳转株,在稳转株中检测到3种靶基因的表达量都出现了不同程度的下降,性发育相关基因除了Leptin-R以外都没有明显变化;转染miR-29 mimic的结果显示,过表达一种miR-29家族成员,不会对同一个家族的其他成员的表达量产生影响;在动物实验方面,利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法,成功构建下丘脑中miR-29b过表达的小鼠模型,miR-29b的表达水平上升4倍左右,在检测与性发育相关基因时,结果显示kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,Gn RH,在生理盐水,空载体FUGW,慢病毒中没有变化,Leptin-R的表达量在慢病毒组中有所下降。模型小鼠与对照小鼠相比在体重增长,阴门开启,合笼时间,子鼠出生数量,子鼠死亡数量等一系列的表型中出现差异,表明miR-29b的过表达对小鼠的性发育产生了影响,为进一步研究小鼠性发育提供了理论依据。
[Abstract]:BACKGROUND : Micro RNAs ( microRNAs ) are a group of highly conserved endogenous non - coding small RNA , which is about 21 ~ 25 nucleotides in length . It can regulate the biological process by targeted binding and cleavage of mRNA or protein translation of m RNA . It is reported that the expression of miR - 29b plays an important role in the development of the mammalian nervous system . It is suggested that miR - 29b can be used as a miR - 29 overexpression cell model . It is suggested that miR - 29b can be used as a miR - 29 overexpression cell model . The expression of miR - 29b was decreased by about 28 - fold , and the expression of miR - 29b was decreased by about 28 - fold , while the expression of miR - 29b was decreased by about 44 % . Compared with the control group , the expression level of miR - 29b was reduced by about 2 g . Compared with the control group , the expression level of miR - 29b was significantly decreased .

【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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