LncRNA-miRNA-mRNA相互作用初步研究

发布时间：2018-02-04 07:06

  本文关键词： LncRNA-miRNA-mRNA 相互作用 分子海绵 降解　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人类的整个基因组中至少有85%左右的DNA能转录并合成RNA,但这些RNA中又只有不足2%的RNA可以翻译成为蛋白质,而余下部分皆不编码蛋白质,这些RNA就被称作“非编码RNA”。随着相关研究的深入进展,人们发现非编码RNA分子能够在不同的水平,通过多种途径调节基因的表达,从而参与细胞、组织乃至整个机体的各项生命过程,从而改变了“一切生命活动以蛋白质为基础”的观念。非编码RNA依照其长度的不同可分为短链非编码RNA、中等长度非编码RNA以及长链非编码RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短链非编码RNA长度小于50 nt,中等长度非编码RNA长度介于50-200 nt,而长非编码RNA长度大于200 nt。而且近年来研究表明,不同长度的RNA之间存在相互作用,特别是LncRNA与miRNA、miRNA与mRNA、lncRNA与mRNA都存在相互调节的关系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互调控网络,理清这一复杂而精细的调控网络,对于揭示RNA分子间的相互作用及阐释其功能至关重要。第一部分:miRNA加速“分子海绵”lncRNA降解LncRNA指的是一类长度大于200个核苷酸,不编码蛋白质的长链RNA分子。现已发现长非编码RNA在哺乳动物细胞中广泛表达,成千上万的长非编码RNA相继被鉴定出来,但是人们对它们的分子机制以及功能研究还处在起步阶段,目前为止,功能已知的非编码RNA也只有100多种。长非编码RNA相比较于编码蛋白的基因表达水平表达一般要低,保守性也比较差,不形成较大的同源家族。一般认为长非编码RNA按来源可分为如下几类:从基因间区转录,从基因的上游区域转录以及基因的反式转录产物;从长非编码RNA的功能上可以将其归为四类分子:指导分子、诱饵分子、信号分子和骨架分子。长非编码RNA能够对细胞的多个生物学活动进行调控,包括转录前的表观遗传学调控、基因转录水平调控、基因的转录后调控、细胞的亚结构的构成及染色体重塑的调控、细胞分化和机体的发育等。此外,研究发现长非编码RNA的异常表达与许多重大的人类有联系,主要包括癌症、神经系统疾病、糖尿病和自身免疫病等。随着研究的深入,lncRNA被发现能够成为mi RNA的“分子海绵”,即lncRNA通过与miRNA结合,减弱miRNA对靶基因的“沉默效应”,从而对miRNA的靶基因进行调控。因此,lncRNA与miRNA的相互作用关系逐渐成为了一个研究热点。针对lncRNA与mi RNA之间的相互作用,结合已有研究报道我们提出了三个科学问题:大部分miRNA的稳定性比较强,半衰期比较长,那么吸收miRNA的“分子海绵”lncRNA稳定性如何;lncRNA与靶mRNA竞争结合miRNA,它们之间的相对丰度是否决定了竞争作用的结果;此外,lncRNA“分子海绵”的作用是否具有普遍性。围绕这三个提问,我们从lncRNA“分子海绵”功能入手,选取了五个具有“分子海绵”的长非编码RNA,这些lncRNA都可以通过竞争结合miRNA,调控miRNA靶mRNA。我们选择了HEK293T和He La细胞作为细胞模型,对细胞内几种lncRNA和mRNA的半衰期进行检测。我们使用放线菌素D对细胞内转录进行了抑制,然后收集五个时间点(0、4、8、12、24h)的细胞总RNA,qRT-PCR检测各个时间点lncRNA和靶mRNA的表达量,结果显示,具有“分子海绵”作用的lncRNA半衰期并不都很长,除lncRNA-UCA1半衰期较长大于24 h,其它lncRNAs半衰期均小于12 h;随后我们检测了lncRNA与mRNA的相对丰度,lncRNA与mRNA的相对丰度有高有低,也并非有分子海绵功能的lncRNA其丰度相对于靶mRNA就高;过表达miRNA,检测lncRNA半衰期,我们发现过表达miRNA使lncRNA的半衰期大大减短,促进lncRNA的降解;随后,我们构建了lncRNA-UCA1的过表达载体,我们发现miR-216b能够加速细胞内源或者外源过表达的lncRNA-UCA1的降解,而且通过使用miR-216b的抑制剂能够抑制miR-216b加速降解lncRNA-UCA1的作用。上述结果提示,lncRNA作为miRNA的“分子海绵”的作用是通过lncRNA以碱基互补配对方式与miRNA的靶mRNA竞争miRNA,降低了游离miRNA的含量,从而实现对靶mRNA的调控,同时lncRNA结合miRNA之后,其也作为miRNA一个靶基因,mi RNA降低lncRNA的稳定性,促进其降解。第二部分:lncRNA抑制miRNA对非完全匹配靶mRNA的降解miRNA(microRNA)指的是一类长度大约18-22 nt的单链非编码RNA分子,miRNA具有高度保守性、组织的特异性以及时空特异性。miRNA在转录后水平调控基因表达,其通过碱基互补与靶mRNA的3’端非翻译区域(3’translated region,3’UTR)结合,导致靶mRNA剪切或者翻译抑制,从而调控靶基因的表达。现在认为,miRNA主要通过两种方式对靶基因进行“沉默”,一种是miRNA与靶mRNA 3’UTR区结合位点完全匹配,引起Ago2(Argonaute 2)蛋白介导的靶mRNA剪切,从而引起mRNA分子的快速降解;而另一种指的是,miRNA与mRNA的3’UTR区域形成不完全的碱基降解,这时引起靶mRNA的翻译抑制,以实现靶基因的调控。miRNA已被发现参与生物体的多项生命活动,其在细胞内基因表达,细胞分裂增殖,细胞分化,细胞凋亡乃至生物体的发育都起到相当重要的作用,而且miRNA的异常表达与多种疾病也有较为紧密的联系。LncRNA-GAS5作为miR-21的细胞内天然“分子海绵”,能够通过与miR-21结合从而吸收miR-21,抑制miR-21对靶基因的作用。PTEN和TPM1是miR-21的非完全匹配靶基因。我们首先在HEK293T细胞和HeLa细胞验证mi-21能够通过与PTEN和TPM1非完全互补调控PTEN和TPM1蛋白的表达,但并不影响PTEN和TPM1的mRNA的表达量;此外,过表达miR-21后,qRT-PCR检测PTEN和TPM1 mRNA的半衰期,发现它们的半衰期显著缩短,mi R-21加速PTEN和TPM1 mRNA的降解。通过转染lncRNA-GAS5的过表达质粒,我们发现lncRNA-GAS5竞争性的与miR-21结合能够延长PTEN和TPM1 mRNA的半衰期。上述结果提示我们,lncRNA-GAS5作为miR-21的“分子海绵”能够抑制miRNA对其非完全匹配靶mRNA PTEN和TPM1的降解。LncRNA与mRNA存在这样的相互作用,能够帮助我们理解并完善lncRNA-mi RNA-mRNA调控网络。第三部分:相关表达载体的构建及表达验证为了探究mRNA是否能够调控lncRNA的稳定性和丰度,我们需要构建靶mRNA的3’UTR区表达载体。miR-21靶基因TPM1 3’UTR区真核过表达载体的构建,miR-216b靶基因FGFR1 3’UTR区真核过表达载体的构建,以及上述载体的表达验证;miR-21靶基因PTEN和TPM1 3’UTR荧光素酶载体的构建。结果显示,这些过表达载体以及荧光素酶载体的构建成功,为后一步更加深入的研究lncRNA-miRNA-mRNA相互作用关系,提供了强有力的工具。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Wei-Zhong Sheng;Yu-Sheng Chen;Chuan-Tao Tu;Juan He;Bo Zhang;Wei-Dong Gao;;Micro RNA-21 promotes phosphatase gene and protein kinase B/phosphatidylinositol 3-kinase expression in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2016年24期

2 Gabriel Eades;Yong-Shu Zhang;Qing-Lin Li;Ji-Xiang Xia;Yuan Yao;Qun Zhou;;Long non-coding RNAs in stem cells and cancer[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年02期

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本文编号：1489654