基于多基因调控的莱茵衣藻油脂代谢及分泌的研究

发布时间：2018-02-25 08:14

本文关键词： 莱茵衣藻脂肪酸分泌酰基辅酶A合成酶 DOF转录因子多基因调控　出处：《深圳大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着化石能源的枯竭和环境污染的加剧,新一代微藻生物柴油技术受到了广泛关注。利用基因工程手段调控微藻油脂关键基因,增加微藻油脂含量的研究已成为降低微藻柴油成本的重要途径。到目前为止,本实验室利用模式微藻——莱茵衣藻,进行油脂代谢调控的研究也取得了重要进展:一方面我们发现在莱茵衣藻中过表达DOF转录因子,能显著增加其胞内的油脂含量;另一方面,我们也发现在莱茵衣藻内分别沉默长链酰基辅酶A合成酶的两个基因ACS1和ACS2也能增加胞内油脂含量,并且能在一定程度上实现微藻的脂肪酸胞外分泌。但是上述基因之间是否存在相互关系?能否对这些基因进行同时调控?基于这些问题,我们开展了本研究。本论文采用了连续多次转化的方式构建出ACS1和ACS2共沉默的工程藻Mq12,在莱茵衣藻中实现了多基因的共沉默。与单基因沉默藻株相比,共沉默工程藻的胞内油脂含量有明显提高。在此基础上,本论文也进一步构建了沉默ACS2同时过表达DOF的工程藻株Mc7。与单基因调控藻株相比,工程藻的胞内油脂含量也有显著增加,并且其胞外脂肪酸的分泌量也有明显提升。证实了多基因共调控策略在微藻产油调控中的重要意义。本论文的具体研究结果如下:1.构建了ACS2基因的RNA干涉载体pMaa7IR/ACS2IR。该载体在莱茵衣藻中表现出巴龙霉素抗性,含有来源于ACS2的421 bp片段组成的发卡结构,该发卡结构受莱茵衣藻RBCS2启动子调控,可高效抑制衣藻内源ACS2基因的表达量。2.采用连续转化的方法,将pMaa7IR/ACS2IR转入已沉默了ACS1基因的工程藻,经BODIPY染色筛选获得ACS2和ACS1基因高效共沉默的工程藻株Mq12。荧光定量PCR检测显示,工程藻Mq12中ACS1基因的表达量下调了63%,ACS2基因表达量下调了82%。微藻胞内甘油酯含量测定结果表明,共沉默藻株Mq12的胞内甘油酯含量分别比野生藻株CC849、ACS1单沉默藻株Q15和ACS2单沉默藻株P13提高了200%、73.5%和46.6%。利用GC-MS测得Mq12胞内总脂含量为167.1μg/mg,与CC849、P13、Q15均存在极显著性差异,分别提高了65%、23%和38%。其中Mq12中C18:3n3和C18:1c与CC849相比分别提高了6倍和2.5倍。这表明ACS1与ACS2共沉默能显著提高莱茵衣藻胞内甘油酯和总脂含量。而胞外脂肪酸数据显示,Mq12分泌的脂肪酸虽然与CC849相比提高了19%,但是与P13和Q15相比并无显著差异。3.采用连续转化的方法,将pMaa7IR/ACS2IR转入DOF转录因子过表达的工程藻C12中,经BODIPY染色筛选获得ACS2和DOF共调控的工程藻株Mc7。胞内甘油酯含量测定表明,工程藻Mc7的胞内甘油酯含量与野生藻CC849、DOF转录因子过表达藻株C12和ACS2单沉默藻株P13相比都具有极显著性差异,分别提高了91%、40%和48%。此外,Mc7的胞内总脂肪酸含量与CC849、C12和P13相比分别提高了90%、29%和42%,其中与CC849相比,不饱和脂肪酸有大幅度上升。更重要的是,胞外脂肪酸数据显示,Mc7的胞外脂肪酸总量与CC849、C12、P13相比,均具有极显著性差异,分别提高了67.4%、35.88%、21.5%。与CC849相比,Mc7胞外不饱和脂肪酸有大幅度提高。这一结果表明共调控ACS2基因与DOF转录因子能显著提高莱茵衣藻胞内油脂含量,特别是TAG含量,且其胞外分泌量有明显增加。综上所述,本研究在莱茵衣藻中建立了多基因共调控的方式,实现了对ACS基因和DOF转录因子的同时调控,最终获得了既能提高胞内油脂含量又能向胞外分泌脂肪酸的转基因藻株,证实了ACS和DOF在提高胞内油脂含量和促进脂肪酸分泌的功能上有相互促进效果,为微藻产油提供了新的思路和基础。
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【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

【参考文献】