草酸青霉GH5、GH12家族纤维素酶的异源表达及其生理作用的研究

发布时间：2018-02-27 21:12

本文关键词： 草酸青霉内切葡聚糖酶异源表达酶学性质组成型表达　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：自然界是丰富的生物质资源库。随着化石燃料的枯竭以及生态环境的不断恶化,世界各国的科学家们将目光投向自然界中的可再生资源。利用可再生资源转化获得生物乙醇和生物柴油被寄予厚望。目前,在可再生资源的利用中,酶解法因为温和的反应条件,不产生有毒物质等优点受到青睐。目前通过遗传操作改造单一酶组分活性来提高纤维素降解能力是一个有效的途径,但想大幅提高纤维素酶系的纤维素降解能力很难。研究纤维素酶系各组分酶学性质和功能,对于完善纤维素酶系的功能,重构适合不同底物的酶复合物具有重要意义。大部分纤维素酶基因为诱导表达基因,在非诱导条件下存在基础性表达。普遍接受的模型是,基础性表达的纤维素酶将外源纤维素降解为纤维寡糖,纤维寡糖进一步诱导纤维素酶基因的表达。除了诱导型基因外,还存在组成型表达的纤维素酶基因,在诱导前期,这些非诱导型纤维素酶与基础性表达纤维素酶一样——将纤维素降解为纤维寡糖,促进纤维素酶基因的诱导表达。鉴定这些纤维素酶的功能,对于纤维素酶基因诱导调控网络的完善具有重要意义。本论文的主要研究进展如下:1.内切纤维素酶在毕赤静母中的表达设计 Cel5B、Cel5D、Cel5E、Cel5F、Cel12A、Cel12B 和 Cel12C 编码基因引物。将酶切位点加在引物的5'端,并在C端添加6-8个His标签。以114-2的cDNA为模板,扩增得到了其中的7个目的片段。通过限制性核酸内切酶处理目的片段和载体,连接构建重组载体。通过电转化的方法将线性化的重组载体转入毕赤酵母。甲醇诱导重组蛋白的表达,并通过SDS-PAGE进行分析,成功获得重组蛋白 rCel5B、rCel5E、rCel12A、rCel12B 和 rCel12C。2.重组蛋白的获得和酶学性质测定通过亲和纯化获得重组酶蛋白rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCe15B和rCel5E。以刺槐豆胶、木聚糖、CMC-N玖、pNPG、pNPX、水杨苷、蔗糖、果胶、淀粉和聚半乳糖醛酸10种底物测定重组蛋白的底物特异性。结果显示,它们均属于纤维素内切酶。rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B 和 rCel5E 降解 CMC-Na 的比活力分别为 2.46IU/mg、0.97IU/mg、0.63IU/mg、2.32IU/mg 和 5.07IU/mg。其中 rCe15E 降解 CMC-Na 的能力是 rCe15B 和 rCel12A 的 2 倍,是 rCel12B 的 5.2倍、rCel12C的8.0倍。重组蛋白中,rCel12A的最适温度是50°,其余4种重组蛋白的最适温度均为60℃。它们的最适pH处于4-6之间,其中rCel5B、rCe15E和rCel12B的最适pH为4,rCel12C的最适pH为5,rCel12A的最适pH则为6。热稳定性实验显示,rCel12A耐热性差,在50℃下保温30min之后,活力仅为初始的25%。rCel12B在50℃下保温120 min后依然能保持50%的活力。在60℃下保温120 min后,rCel5B和rCel5E依然保持有最初活力的60%-70%,但在70℃下,所有重组内切酶均快速丧失活力。结果显示GH5家族的rCel5B和rCel5E的热稳定性要好于来自于GH12家族的rCel12A和rCel12B。重组内切酶水解再生无定形纤维素(RAC)的结果显示,产物主要为二糖和三糖。3.组成型纤维素酶的功能初探以草酸青霉114-2为出发菌株,通过同源重组的方式获得Δcel12C、Δcel5E、Δcel5F、Δcel61B和 Δcel61C5个单基因敲除株,Acel12CΔcel5E、Δcel5FΔcel5E、Δcel61BΔcel5E、Acel61BΔcel5F、Acel61CΔcel5E 和 Δcel61CΔcel5F6 个双基因敲除菌株。各基因敲除株与野生菌株相比,在葡萄糖、PDA和纤维素培养条件下的表型以及孢子萌发水平未见明显差异。cel12C、ce15E、cel5F、cel61B和cel61C的生物学功能需要继续探索。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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