海洋球石藻病毒参与宿主新型鞘脂类合成途径关键酶基因的克隆及其功能分析

发布时间：2018-03-06 09:43

本文选题：海洋球石藻　切入点：海洋球石藻病毒　出处：《集美大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鞘脂类是目前脂类研究的热点之一,作为食物中的一种天然成分,鞘脂可以归为食物中的“功能成分”。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)是一种海洋真核浮游植物,能够产生丰富的次级代谢生物活性物质。特别是该藻被特异性病毒(E.huxleyi virus:EhV)感染后能够合成一系列具有特殊结构的新型鞘脂类活性物质,这些鞘脂类有望开发为新型的天然食品和医药资源。EhV86及其宿主EhCCMP1516全基因组测序注释结果显示,EhV86基因组中存在7个预测编码鞘脂类合成途径(SBP)关键催化酶的基因,包括丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、长寿保障基因类蛋白(LAG1)、脂肪酸去饱和酶(FAD)、酯类磷酸酶(LPP)、甾醇去饱和酶(SD)、糖基转移酶(GT)及跨膜脂肪酸伸长蛋白(TFAE)。正是病毒基因组编码的这些酶在一定程度上掌控着宿主藻细胞鞘脂类的代谢,从而合成并积累宿主新型的鞘脂类物质。到目前为止,上述几种酶中只有SPT功能和生化特性进行了初步研究,其他几种鞘脂类代谢途径中酶的功能和确切位置还有待确定。本论文选择其中两种关键酶,即SD和FAD为研究对象,从海洋球石藻病毒EhV99B1基因组中克隆获得该两种酶基因,对其结构特点进行了系统的生物信息学分析;然后通过基因工程技术初步分析这两种酶在酵母细胞鞘脂类代谢途径中可能的作用;对本实验室已建立的海洋球石藻遗传转化系统进行了优化改进。为进一步构建海洋球石藻生物反应器、合成积累新型鞘脂类资源提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下:(1)应用PCR技术从球石藻病毒EhV99B1基因组中扩增获得上述两种酶基因。其中甾醇去饱和酶SD基因全长987bp,编码328个氨基酸,该蛋白的理论等电点为8.31,分子量为37.83kDa,为疏水性、不稳定蛋白,存在6个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中螺旋含量最多。脂肪酸去饱和酶FAD基因全长963bp,编码320个氨基酸,该蛋白的理论等电点为7.26,分子量为37.67kDa,属于亲水性、稳定蛋白,存在4个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中也是螺旋结构含量最多。系统发育分析结果显示,病毒这两种基因与宿主球石藻及金色藻属亲缘关系较近。(2)构建了酿酒酵母重组表达载体pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD,通过醋酸锂的方法转化酿酒酵母菌株INVSc1,对筛选获得的阳性菌株用D-半乳糖诱导目的基因表达,SDS-PAGE检测到目的蛋白的表达,其分子量分别为甾醇去饱和酶SD为37.8 kDa,脂肪酸去饱和酶FAD为37.6 kDa。重组酵母细胞与原始酵母细胞的总脂薄层层析结果有较大的差别,表明病毒甾醇去饱和酶SD和脂肪酸去饱和酶FAD能够改变酵母细胞中脂类组成及含量变化,具有一定的催化活性。(3)利用基因工程技术从pBar、pGFP质粒和E.huxleyi BOF92基因组中成功克隆了海洋球石藻内源性启动子FCP-P基因,终止子FCP-T基因、草铵膦抗生素抗性基因Bar、绿色荧光蛋白基因GFP。以psp73作为基础载体,利用不同酶切位点成功构建了pEhux-I(psp73-FAP-Bar-FAT1-FBP-FAT2)载体和pEhux-II(psp73-FAP-GFP-FAT2)载体;采用PEG介导的方法将两个载体共转化海洋球石藻BOF92细胞,荧光显微镜观察到部分转化细胞中绿色荧光蛋白基因的表达,通过草铵膦筛选获得成功转化的藻细胞株;实时荧光定量PCR和Western bloting检测进一步验证转化细胞中Bar基因的稳定表达。以上研究结果初步确定了病毒两种酶基因表达产物具有一定的催化活性,优化后的球石藻遗传转化系统能够诱导目的基因的稳定表达,为进一步构建含有病毒SD和FAD基因的球石藻工程藻株奠定了基础,也为实现海洋球石藻新型鞘脂类的产业化生产及应用提供了科学依据。
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【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】