主要海藻多糖降解酶活性架构及其降解模式分析

发布时间：2018-03-12 13:24

本文选题：主要　切入点：海藻　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：海藻以其丰富的含量和显著的工业价值日益被人们重视而。海洋藻类种类繁多,主要以褐藻和红藻为主。琼胶、卡拉胶和褐藻胶等海藻胶是海洋藻类的主要成分。面对如此庞大的海藻多糖生物质,海洋异养微生物能够消化高分子量的海藻多糖有机物,将其分解为低分子量物质。海洋不计其数的与海藻多糖降解相关的微生物,利用自身基因所编码表达的糖苷水解酶(GH)和糖苷裂解酶(PL)参与重要的代谢途径。从分子层面进行分析和表征GH和PL相关酶类将会为海洋碳循环研究提供新的思路。本项研究主要对海洋和陆地环境样品进行样品富集和菌株筛选,希望获得能够降解海藻多糖的的菌种和基因资源。利用结构生物信息学分析海藻多糖降解酶底物识别的特异性和混杂性模式,推测酶参与催化的关键氨基酸,这将能深入地理解海藻多糖酶高效降解海藻多糖的分子基础。本研究集中于活性架构区域,推测关键氨基酸残基功能,试图阐明酶催化底物的机制。同时也对分离到的其它有特定功能的新菌进行分离和鉴定。1.对近海和陆地环境样品进行了广泛地筛选,获得了两株细菌新物种并对其进行物种鉴定分析发现,在威海近海海参养殖池的沉积物以及西藏纳木错湖湖水样品中分离到一些潜在的新种,本研究对分离到的标号为N39~T和XZ17~T两株疑似新菌进行了分类鉴定,确定了其系统发育地位。分子进化分析、表型分析、化学组分分析和生理生化分析的结果表明:N39~T和 XZ17~T代表了科迪单胞菌属和类诺卡氏属的一个新种,根据以上特征分析,将其分别命名为底泥科迪单胞菌Kordiimonas sediminis和黄色类诺卡氏菌Nocardioides gilvus。2.利用结构生物信息学方法分析了三类海藻多糖降解酶底物识别特异性和混杂性的模式利用结构生物信息学的方法探索了三类海藻多糖降解酶(琼胶酶,卡拉胶酶和褐藻胶裂解酶)活性架构区域底物结合模式。分析显示,五个海藻多糖降解酶家族的活性架构处某些氨基酸残基相比全酶其频率升高,特别是碱性氨基酸H和R升高幅度最大。这表明极性氨基酸残基能够与底物的特异性基团如硫酸根、羧酸根或内醚氧之间形成氢键或静电相互作用,以此来识别海藻多糖底物。-2和+3亚位点保守氨基酸残基要明显多于其它亚位点,这也是每个家族的共同识别位点。进一步研究发现,每一类的同工酶在降解同一种底物时扮演着不同的角色,往往以一种合作的方式共同降解。结合基因组测序发现,来源于同一种微生物的不同家族的酶能够协同降解同一种底物,也许会更高效或更完全。3.完成了褐藻胶裂解酶AlyV4的异源表达、分离纯化,并对其酶学性质进行了表征将海洋弧菌Wibrio sp.QY104中表达的褐藻胶裂解酶基因alyV4连pET-28a(+)载体上,将其转入E.coliBL21(DE3)获得了后重组蛋白的活性表达。对AlyV4的酶学性质检测分析显示,该酶的最适温度和pH分别为40℃和pH 7.6。底物专一性分析表明,该酶能够降解褐藻酸的三种成分即PMG、PM和PG。构建进化关系得知AlyV4属于PL7-5家族。该酶的比酶活为5686.28 U/mg,k_m k_(ca)和分别为 1216 mg/mL 和 6274.03 S~(-1)。4.对PL7家族褐藻胶裂解酶AlyV4活性架构处关键氨基酸残基功能进行了分析通过活性架构处保守氨基酸残基及Lid-loop上关键氨基酸残基的突变,发现各突变体酶活均降低85%以上,可以推测出这些氨基酸残基在酶的催化过程中起到关键作用。荧光光谱法可以灵敏测得各突变体的结合力,结果发现突变体的底物结合力下降,最多降低了 45%左右。酶活与底物结合力降低程度的不对等程度强烈暗示着酶的催化过程不仅只是包括底物结合、催化和产物释放的过程,在底物的结合与催化之间也可以细分为几个阶段。最初酶与底物之间进行结合以后,活性架构处的关键氨基酸残基接着要发挥辅助催化断键的功能,例如-1亚位点的残基需要辅助糖环经过从船式到椅式的转变从而保证催化残基能够顺利催化。对产物的荧光辅助糖电泳表明,突变体S76A/R和Y81A/N的产物谱与野生型相比,其降解四糖以上底物的能力降低,说明单个位点的突变即可导致催化模式的改变。通过对活性架构处关键氨基酸残基功能的分析,可为该酶后续的分子改造奠定了理论与结构基础,具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55

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