高效异槲皮素产生菌的重离子诱变选育及转化条件优化

发布时间：2018-03-15 16:53

  本文选题：异槲皮素　切入点：微生物转化　出处：《河北大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：异槲皮素作为一种药理活性极高的药物是目前医药领域研究的热点,但由于该物质在自然界中含量较低,化学提取合成步骤复杂,影响了异槲皮素的利用推广。生物酶解法转化芦丁定向合成异槲皮素被公认是规模化制备异槲皮素的最有效途径之一。本论文通过~(12)C~(6+)重离子诱变选育高效异槲皮素产生菌并对其进行转化体系及转化条件优化,以期提高酶法生产异槲皮素的生产效率,降低生产成本。对本实验室筛选的能降解芦丁生成异槲皮素的岸滨芽孢杆菌(Bacillus litoralis)C44进行~(12)C~(6+)重离子诱变育种。初步筛选得到330株pH 9.0,32℃条件下长势良好的突变株。定量TLC筛选得到13株α-L-鼠李糖苷酶转化效率提高的菌株,其中M5B15菌株转化效率最高,遗传稳定性最好。在相同条件下,该菌株相对原始菌株C44的转化率为171.3%,利用HPLC进行复筛测得M5B15菌株的摩尔转化效率为出发菌株的1.55倍。对突变菌株M5B15的培养基成分和发酵条件进行了优化。优化前后菌体OD600值分别为2.5±0.12和16.4±0.39,菌体浓度提高了5.6倍。以本实验室前期优化建立的转化条件为基础进一步优化转化体系。结果表明:在pH9.0甘氨酸-氢氧化钠转化体系中,加入3 g/L芦丁,湿菌体浓度在100 g/L时,底物完全转化为产物的最短时间为10 h,比优化前缩短14 h,比出发菌株缩短38 h;经HPLC分析,底物的转化率是优化前的2.27倍,是原始出发菌株的4.62倍,有效地提高了底物的转化效率;在超声功率为25 kW,超声乳化时间30 min条件下,大豆卵磷脂能够与浓度为10 g/L的芦丁以摩尔比1:1产生良好的包合作用,并且加入大豆卵磷脂后菌株的相对转化率提高12.6%。研究得出,1L体系的最佳反应条件为底物浓度10 g/L,细胞浓度为350 g/L,转化时间24 h。进一步研究得知,在转化体系中添加浓度为20 g/L葡萄糖和10 mmol/L Zn2+,底物转化速率提高18.0%。本论文通过对异槲皮素产生菌C44进行~(12)C~(6+)重离子诱变育种,最终筛选得到一株高活性突变株M5B15,在底物浓度3 g/L时,其细胞转化时间大大缩短,摩尔转化效率明显提高;对突变菌株M5B15的培养基成分与发酵条件的优化有效提高了菌体单位时间的生物量,降低了发酵成本。通过对转化体系的优化,缩短了底物浓度3 g/L时的转化时间,底物转化效率显著提高。通过对底物芦丁的乳化包合,将底物溶解度由3 g/L提高到10 g/L,同时将转化体系扩大至1 L,为异槲皮素的规模化生产奠定了基础。
[Abstract]:Isoquercetin, as a drug with high pharmacological activity, is a hot topic in the field of medicine. However, because of its low content in nature, the chemical extraction and synthesis process is complex. The application of isoquercetin was affected. It was recognized that the bioenzymatic transformation of rutin into isoquercetin was one of the most effective ways to produce isoquercetin on a large scale. In this paper, high efficiency isoquercetin was selected by heavy ion mutagenesis. The transformation system and transformation conditions of dermatocyte-producing bacteria were optimized. In order to improve the production efficiency of isoquercetin by enzymatic method, In order to reduce the production cost, a strain of Bacillus litoralis)C44, which could degrade rutin to produce isoquercetin, was screened by heavy ion mutagenesis. 330 mutant strains with good growth at pH 9.032 鈩，

本文编号：1616180