条纹斑竹鲨TBC1D15蛋白的结构研究

发布时间：2018-03-16 03:04

  本文选题：TBC1D15　切入点：条纹斑竹鲨　出处：《浙江理工大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：TBC结构域(Rab-GAP)是一段约由200个氨基酸残基组成的高度保守的氨基酸序列,几乎所有真核生物都含有TBC结构域的蛋白。TBC1D15(TBC1 domain family member15)作为含TBC结构域大家族的其中一员,参与多种生理功能,对生物体具有重要的调控作用。根据现有的研究表明,TBC1D15是一种高度保守的蛋白,具有GTP酶激活蛋白活性,同时对Rab7也具有明显的底物偏爱性。TBC1D15能通过调节Rab7进而来调节溶酶体的形态,此外,它在维持生长因子依赖性上同样具有重要的作用。条纹斑竹鲨TBC1D15最早是在其肝脏中发现的,其基因序列包含有4213个碱基对。另外,条纹斑竹鲨TBC1D15的N端具有APSL(鲨肝活性肽)结构域,此结构域与条纹斑竹鲨肝脏再生有关,能够降低2型糖尿病小鼠的血糖水平,另外还具有显著的免疫调节和抑制脂质体氧化的作用。本课题组通过体外酶促反应实验发现,条纹斑竹鲨TBC1D15对Rab7a具有GTP酶激活蛋白活性。尽管我们已经通过体外实验,测定了条纹斑竹鲨TBC1D15的GAP活性,但是对于这一催化机制还尚未清楚。到目前为止,也没有TBC1D15的结构模型来帮助我们解释这一机制,因此希望利用晶体学的方法来解析条纹斑竹鲨TBC1D15的蛋白结构以及其与作用蛋白Rab的复合结构。本实验根据全长的TBC1D15(条纹斑竹鲨Shark、人Homo、猪Sus、鼠Mus)蛋白序列,利用生物信息学的方法分析Rab-GAP的二级结构,并对这四种蛋白分别设计4个不同的截短,通过蛋白的表达、纯化和HPLC鉴定,筛选出性状最优的蛋白。之后通过蛋白的结晶实验,初步筛选出适宜的蛋白结晶条件,再根据蛋白结晶条件的优化,得到高分辨的蛋白晶体。结果表明,Sus GAP-2、Shark GAP-2、Homo GAP-2以及Mus GAP-2均具有很好的表达性质,通过蛋白结晶实验,获得Shark GAP-2和Sus GAP-2这两种蛋白晶体。通过后续的蛋白结晶条件优化、数据收集和结构解析工作,得到了分辨率分别为2.8?(Shark GAP-2)和2.5?(Sus GAP-2)的晶体结构。将这两个蛋白结构进行比较,发现其结构极其相似,这也证明了TBC1D15在进化上的高度保守性。另外,与酵母Gyp1p和TBC1D1的结构比较中发现,尽管它们都是由16个α螺旋组成,没有β折叠结构,但还是有很多结构上的差异,这说明了我们分离、纯化,解析得到的Shark GAP-2和Sus GAP-2晶体结构,是全新的蛋白结构,这也是对TBC家族蛋白结构的补充。另外,以Rab11a和Rab7a作为底物,对Shark GAP-2和Sus GAP-2进行体外GAP(GTPase-activating protein)活性测定。结果表明,这两种蛋白均能够加速Rab11a和Rab7a水解GTP形成GDP。基于Shark GAP-2和Sus GAP-2的蛋白结构,对Shark GAP-2和Sus GAP-2催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺分别设计突变:Shark GAP-2(R437A、R437K、Q474A)和Sus GAP-2(R400A、R400K、Q437A)。对这一系列突变蛋白进行GAP体外活性测定,发现突变后的蛋白活性丧失。这证明了催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺是关键的催化氨基酸,其任意一个突变都将导致GAP活性的丧失。最后,尝试将Shark GAP-2和Sus GAP-2分别与Rab7a和Rab11a进行共表达和串联表达,以此来得到GAP蛋白与Rab底物蛋白的复合结构。结果表明,共表达方法并不能够得到想要的蛋白,而串联表达可以获得。对串联表达的蛋白(Shark1215+3GSA+Rab7a/Rab11a、Sus2010+3GSA+Rab7a/Rab11a)尝试进行结晶实验,但均未得到蛋白晶体。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q51

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本文编号：1618022