猪瘟病毒感染细胞的代谢组学及葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究

发布时间：2018-03-21 07:41

本文选题：猪瘟病毒　切入点：代谢组学　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是黄病毒科瘟病毒属的一员,为具有囊膜的单股不分节段正链RNA病毒,基因组全长约12.3 Kb,其含有一个能编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。CSFV引起的猪瘟是猪的一种以广泛出血、高热和免疫抑制为主要特征的烈性传染病。猪瘟爆发造成重大经济损失,被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列为必须申报的动物传染病,我国将其列为一类传染病。目前几乎无治疗猪瘟的方法,因此有必要阐释猪瘟病毒感染时宿主和病毒的互作机制,以便开发出疫苗或者靶向药物以有效控制感染。感染病毒的细胞代谢会发生改变,这些改变不仅能为病毒粒子增殖提供特定的物质合成前体,同时也可增加宿主细胞的生存能力。不同病毒对被感染细胞代谢的改变有既有共性,也有差异之处。许多病毒感染会引起宿主有氧糖酵解即瓦尔堡效应,有些病毒感染能促进宿主脂肪酸合成和谷氨酰胺代谢。因此有必要明确病毒怎么改变细胞代谢以及这些改变发生在病毒生活史的哪个阶段,这将有助于人们更好的理解病毒复制与感染所需要的条件,为抑制病毒在细胞内增殖提供潜在靶点,从而为抗病毒研究提供新思路。本研究采用基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱(Ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-time of flight/mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS)和气相色谱飞行时间质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)的代谢组学方法对猪睾丸细胞(Swine testicle cell,ST)感染猪瘟病毒后12 h、24 h和48 h实验组及对照组的代谢物进行了检测和统计学分析,建立包括主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析在内的多维统计分析模型,并结合单维统计分析筛选出差异代谢物。之后将UPLC-Q-TOF/MS在正负离子两种模式下筛选到的差异代谢物和progenesis QI软件自带数据库比对定性,GC-MS筛选到的差异代谢物通过和NIST数据库及Feihn代谢组学数据库比对判定,综合UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS实验数据可知CSFV感染ST细胞后导致214种代谢物发生改变,其中脂类有102个(磷脂占75个)、氨基酸有36个、碳水化合物有33个、核苷酸有24个,其他如辅酶及激素类物质共计19个。将差异代谢物进行pathway分析,发现ST细胞感染猪瘟病毒后发生紊乱的代谢通路包括磷脂代谢、氨基酸合成、氨酰-tRNA合成、嘧啶代谢、碳代谢及泛酸与辅酶A代谢,氨基酸中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢,代谢组学实验结果证实了猪瘟病毒感染ST细胞后引起宿主细胞代谢的强烈变化。代谢组学结果显示感染猪瘟病毒后,细胞内关键代谢通路中的多个代谢物有明显变化,然而并不清楚这些改变对猪瘟病毒复制的意义。基于此,本课题研究了葡萄糖和谷氨酰胺代谢对猪瘟病毒增殖的影响,首先用特定培养基培养感染CSFV的ST细胞,结果发现培养基中缺乏葡萄糖时,猪瘟病毒滴度显著低于正常培养基组和缺乏谷氨酰胺组。向葡萄糖剥夺培养基中回补一定的葡萄糖,24 h后收集样品测定病毒滴度。结果显示,培养基中葡萄糖浓度在0-1.0 g/L时,病毒滴度随着葡萄糖浓度增加而显著升高,当葡萄糖浓度大于1.0 g/L后,病毒滴度不再随浓度升高而变化,表明1.0 g/L葡萄糖即可实现病毒的最佳增殖。在正常培养基中分别加入0 mM、25 mM和50 mM的葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖(2-deoxy glucose,2-DG),结果显示2-DG处理病毒感染细胞能显著抑制猪瘟病毒增殖,且浓度越高抑制效果越明显。Western blot在蛋白水平验证了葡萄糖对CSFV Npro蛋白表达影响,抗体是针对SM株Npro抗原表位设计,能与SM株的很好反应,但不能与GD53株反应,从感染SM组的结果来看,缺少葡萄糖时,Npro表达量显著下降。结合培养基剥夺葡萄糖实验和葡萄糖回补及抑制实验,可以证明猪瘟病毒正常复制增殖离不开葡萄糖。本研究也初步研究了葡萄糖影响CSFV增殖的具体环节,分别测定胞内和胞外样品的病毒滴度和基因组拷贝数,发现葡萄糖剥夺组胞内胞外的CSFV基因组拷贝数及感染性病毒粒子均显著低于对照组,说明葡萄糖是猪瘟病毒复制成熟必不可缺的物质。缺少葡萄糖组的胞内胞外滴度几乎无差别,而其基因组拷贝数相差10倍以上,可以排除葡萄糖在猪瘟病毒释放时发挥作用。为进一步研究何种葡萄糖利用方式影响猪瘟病毒增殖,在正常培养基中加入草氨酸盐抑制丙酮酸向乳酸代谢,结果发现抑制乳酸产生并不影响感染性病毒粒子的产生,表明无氧糖酵解之外的糖代谢通路影响了猪瘟病毒的增殖。最后检测了感染猪瘟病毒后对糖代谢的影响,结果表明感染猪瘟病毒组的细胞相较对照组摄入更多葡萄糖。本研究用色谱质谱联用的代谢组学技术手段筛选了猪瘟病毒感染ST细胞后引起的代谢改变,首次获得我国猪瘟病毒流行毒株感染细胞的代谢全谱。并结合猪瘟病毒增殖动力学比较不同时间点接种病毒组与对照组差异代谢物,发现猪瘟病毒感染细胞引起糖类、脂类、氨基酸和核苷酸等多种代谢物显著变化,并且不同时间点差异代谢物的种类以及升降变化侧重不同,这与猪瘟病毒生活史相对应。代谢组学结果为猪瘟病毒研究提供了切入点,针对这些代谢紊乱分析研究,将有助于揭示猪瘟病毒复制和致病的分子机制,并为猪瘟病毒的科学诊断防控提供参考。此外我们也进一步探究了个别重要代谢通路改变对猪瘟病毒增殖影响,实验证明谷氨酰胺的有无对猪瘟病毒增殖影响不大,而葡萄糖的存在及正常代谢对猪瘟病毒增殖至关重要,缺少葡萄糖则CSFV无法正常复制,本研究为进一步揭示CSFV复制过程中对宿主细胞糖代谢的调节和利用的机制提供了实验依据。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651

【参考文献】