连接肽对枯草杆菌芽孢衣壳蛋白B表面展示海栖热袍菌脂肪酶Tm1350的影响

发布时间：2018-03-30 01:10

  本文选题：枯草芽孢杆菌　切入点：生物活性　出处：《江苏大学》2017年硕士论文

【摘要】：工业酶是使用生物催化方法生产食品、医药、化工等产品的主要酶源。它们具有手性、立体异构和结构域特异性,并且具有在简单介质(如水)中而不是特定介质(如有机溶剂和其他溶液)中识别底物的能力。脂肪酶是α或β折叠水解酶,也是众所周知的蛋白拆分器。来自嗜热生物的脂肪酶能耐受高温,可用于工业生物过程。而且,这些酶的稳定性和表达可以通过将其展示在芽孢表面上来改善。芽孢展示技术效果显著,低成本,耗时少,因此是很有潜力的技术,可应用于环境、医疗和工业等行业中。芽孢能耐受恶劣的工业环境,包括耐热、耐碱、耐化学溶剂,易于回收和可再利用,因此芽孢展示技术工业中应用前景广泛。酵母菌和细菌(包括革兰氏阳性和阴性菌),是最常被用于展示各种蛋白质的载体,但与孢子不同,由于营养细胞对热、p H和化学物质敏感,易破裂。因此,芽孢是避免这些问题的最佳选择,并且相对于营养细胞展示技术,芽孢展示技术则具有多种应用领域。梭菌和芽孢杆菌的各种菌株都能形成芽孢,但是枯草芽孢杆菌最合适做展示载体,因为根据世卫组织认定它对人类是安全的,被认为是“GRAS”(通常被认为是安全的)。芽孢表面展示技术在工业、疫苗开发、环境等方面有着各种应用,细胞表面展示增强了蛋白质表达稳定性和活性,合适的连接肽会使展示的融合蛋白活性和稳定性增强。在本研究中,以海栖热袍菌和枯草芽孢杆菌染色体基因组作为模板进行PCR扩增脂肪酶Tm1350和Cot B基因,在Tm1350和Cot B之间融合了一系列具有不同长度、刚柔性和残基位置的连接肽基因,将所需基因插入大肠杆菌B.subtilis穿梭载体PHS,构建了重组质粒。将重组质粒PHS-Cot B-LxTm1350转化到枯草芽孢杆菌中并诱导芽孢形成。纯化芽孢,通过western印迹分析证实了Cot B-Lx-Tm1350的表达。检测了各种温度(40-80℃),不同p H(范围4.0-10)和不同有机溶剂对含各种连接肽的芽孢表面展示酶生物活性的影响。结果表明所有芽孢展示的融合蛋白的最适温度为75℃,L8和L10的最适p H为8.5,对于L0,L5,L6和L9,最适p H为9.0,而对于L1,L2,L3,L4和L7最适p H为9.5。在最佳温度和p H下,具有较长柔性连接肽L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)和L7(GGGGS-GGGGS-EAAAK-EAAAK-GGGGS-GGGGS)的融合蛋白具有比原始活性高1.29和1.16倍的活性。此外,在80℃下,孵育5小时后,具有连接肽L3(EAAAKGGGGS)和L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)的展示酶热稳定性最好,分别比原来的活性高1.40和1.35倍。测定了不同氨基酸残基位置取向和长度的连接肽的展示酶生物活性,其中L5,L6和L7含有30个不同氨基酸残基取向的连接肽的测定结果表明L7展示酶的活性分别是L6和L5的1.05和1.27倍。研究了0.1%蛋白酶K和菠萝蛋白酶,20%乙醇和30%甲醇对含连接肽的重组芽孢活性的影响。具有适当甘氨酸残基(柔性)的连接肽展示比丙氨酸残基(刚性)具有更高的活性。综上所述,为了提高工业过程中展示酶的活性和稳定性,通过在一定程度上优化连接肽的氨基酸残基位置取向和刚柔性,能达到改善效果。
[Abstract]:Industrial enzymes are food production, use of biological catalysis method and medicine, the main source of enzyme chemical products. They are chiral, stereoisomers and domain specificity, and is simple in medium (such as water) instead of specific media (such as organic solvent and other solution) in recognition of substrate ability. Lipase is alpha protein folding or beta hydrolase, the splitter is as everyone knows. From thermophilic lipase can withstand high temperature, can be used in industrial process. Moreover, the stability and expression of these enzymes can show it to improve on the surface of spore bacillus. Display significant effect, low cost, less time-consuming, so it is very promising the technology can be applied to environmental, medical and industrial industries. Spores can withstand the harsh industrial environment, including heat resistance, alkali resistance, chemical solvent resistance, easy recovery and recycling, so the spore display technology industry 涓氫腑搴旂敤鍓嶆櫙骞挎硾.閰垫瘝鑿屽拰缁嗚弻(鍖呮嫭闈╁叞姘忛槼鎬у拰闃存，

本文编号：1683675