5的克隆表达、纯化及其生物学活性的研究

  本文关键词：Latcripin-5的克隆表达、纯化及其生物学活性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《大连医科大学》 2015年

Latcripin-5的克隆表达、纯化及其生物学活性的研究

曹淑云  

【摘要】：香菇C91-3菌株是由我课题组多年筛选得到的一株药用真菌。本实验组经过对香菇C91-3菌株转录组多年的测序和其功能的解析,从而初步的筛选出17条与细胞活性相关的基因。我们通过利用RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends,快速cDNA末端扩增)技术获得所筛选基因序列的全长。本实验研究关注的是经帅选出的所有功能基因中的第5条基因,所以将其命名为latcripin-5基因(简称为LP-5)。我们通过对latcripin-5基因的生物信息学比对,从而得出该基因具有降解核酸的作用。目的:本实验主要是通过构建香菇C91-3菌株pET32a(+)-latcripin-5的原核重组表达载体,并使原核重组表达载体在大肠杆菌Ecoli.R中进行诱导表达。通过对诱导表达产物的生物学活性的检测,来确定香菇中具有对细胞核酸发生降解作用和生物活性作用的功能性蛋白。①通过生物信息学软件寻找并确定Latcripin-5基因序列及其功能蛋白。②将构建的重组原核表达载体中的Latcripin-5基因转入大肠杆菌Ecoli.R中进行诱导表达,并对诱导表达的产物进行生物学活性及功能的鉴定,为探讨其对细胞核酸作用的机制做好充分的准备。方法:第一部分:①从被筛选出的香菇C91-3菌株中的菌丝体中提取全部的RNA,本实验室根据转录组测序得到的数据结果,用RACE技术获得latcripin-5基因全长,利用生物信息学软件对latcripin-5蛋白的理化性质、氨基酸组成进行分析,并对latcripin-5蛋白的功能结构域进行预测。②将latcripin-5的功能域基因endonuclease-ns克隆到原核表达载体pet32a(+)中,从而构建出pet32a(+)-latcripin-5这种原核重组表达质粒。③将此原核重组表达质粒转化到大肠杆菌ecoli.r中并对其进行诱导表达,将诱导表达的产物进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)电泳和westernblot的方法进行鉴定。④用镍柱亲和层析的方法来分离纯化重组表达的latcripin-5蛋白。第二部分:①把得到的纯化的重组表达latcripin-5蛋白进行复性和除盐以及浓缩,并将浓缩后的蛋白进行浓度测定。②将得到的复性并浓缩后的蛋白与人类基因组dna作用,用酶切的方法检测复性所得蛋白的活性的是否存在。③将已确定活性存在的不同浓度的latcripin-5蛋白作用于人肺癌细胞a549和鸡胚细胞,用mtt(methylthiazolyltetrazolium,四甲基偶氮唑蓝)的方法测定latcripin-5蛋白对细胞的抑制作用。④用33258荧光染色法、流式细胞术的方法检测latcripin-5蛋白对细胞凋亡和细胞周期的作用;用电镜法检测latcripin-5蛋白对细胞的微型结构的作用。结果:第一部分:①利用双酶切的实验方法确定插入到pet32a(+)中的基因片段为latcripin-5的基因片段。通过对latcripin-5蛋白结构域进行分析,证明latcripin-5蛋白的结构域为非限制性核酸内切酶(endonuclease-ns)的结构域。②运用sds-page电泳和westernblot方法得到的结果显示大肠杆菌ecoli.r所表达的蛋白为latcripin-5蛋白。③sds-page电泳可以看出经镍柱亲和层析的到了纯化的目的蛋白。第二部分:①sds-page电泳和westernblot结果显示得到了复性除盐并浓缩后的蛋白。②测定表达蛋白浓度时我们运用bradford的方法,得到标准蛋白的直线方程为y=0.0537x+0.0021,r2=0.9950。③用重组表达的蛋白进行酶切的方法得到的结果显示,该蛋白对核酸具有浓度梯度、温度梯度依赖性。④用mtt的方法检测得到的结果显示,不同浓度的latcripin-5蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用与对照组比较明显的差异,而不同浓度此蛋白对鸡胚细胞的生长抑制作用与对照组同样比较有差异。⑤用流式细胞术得到的结果显示,此蛋白具有诱导细胞凋亡的作用,Latcripin-5蛋白的浓度为200μg/ml时诱导凋亡的作用最强;此蛋白对细胞周期检测的结果显示,在200μg/ml的Latcripin-5蛋白作用下目的蛋白作用后主要阻滞在细胞的G1期,G2期的细胞比例不变,S期的细胞所占比例减少。⑥33258荧光染色法观察细胞凋亡结果显示,细胞核有明显的皱缩现象。⑦电镜法检测其对肿瘤细胞微型结构结果显示,细胞的细胞核发生明显的降解现象,细胞变大,胞浆浓度降低。结论:①将测序得到的香菇C91-3菌株的全部转录组序列进行基因比对,根据基因功能注释的初步结果,本实验室成功获得了latcripin-5基因的全长。②本实验组成功构建了pET32a(+)-latcripin-5的重组质粒;重组表达的Latcripin-5蛋白在大肠杆菌Ecoli.R中得到了成功表达;Latcripin-5蛋白经镍柱亲和层析的方法被成功纯化。③Latcripin-5蛋白对人类基因组核酸具有酶切作用,同时对细胞核酸具有酶切作用和其具体机制有待深入研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

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