苦荞膜联蛋白基因FtANX1的克隆及其对环境胁迫的响应研究

发布时间：2020-11-22 02:11

　　 植物在进化中形成了一系列适应环境的机制,膜联蛋白就是其中之一,它在植物生长发育、响应环境胁迫中发挥着重要作用。本课题以“川荞3号”为研究对象,对苦荞膜联蛋白基因及其启动子进行了克隆鉴定,探讨该基因的结构、进化关系、亚细胞分布、组织表达模式,及其参与苦荞逆境胁迫的应答模式,为进一步培育抗逆植物奠定基础。主要结果如下：1.采用RACE克隆了一条苦荞膜联蛋白基因,命名为FtANX1。DNA全长1650bp,含5个外显子,4个内含子。CDS全长942 bp,编码313个氨基酸残基,相对分子质量36.06 KDa,等电点5.94。FtANX1具有4个典型的annexin保守域,全α-螺旋结构,含1个典型的Ⅱ型Ca2+结合位点。FtANX1氨基酸序列与其他膜联蛋白相似度在49-60%之间。翻译后修饰位点预测发现该蛋白含10个磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个细胞附着位点。Swiss-Model进行三维结构预测,发现其与甜椒AnnCaP32三维结构相似度最高(50.16%)。聚类分析显示,植物膜联蛋白分为四大类,FtANX1与棉花AnnGh5、草莓Annfaf和苜蓿AnnMt1属于第二类。2.利用genome walking技术获得FtANX1基因翻译起始密码子(ATG)上游长约1563 bp序列。序列分析显示其具有启动子基本的核心元件,转录起始位点(TSS)距ATG上游54 bp；TATA-box距TSS上游31 bp。PLACE数据库分析表明该启动子含较多生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件。3.采用qRT-PCR技术分析FtANX1在苦荞花期组织中的表达情况,发现该基因在所检测的组织中均有表达,在未成熟果实中表达量最高,成熟果实、花、茎、根中表达量次之,叶中表达量最少,与果实发育过程密切相关。4.采用qRT-PCR技术分析FtANX1在苦荞逆境胁迫下的表达模式,结果表明：与对照相比,JA、UV-B处理下,FtANX1表达量在24 h时分别增加到9.79+0.89、10.71±0.40；NaCl处理下,FtANX1转录水平增加,且在12h时较高；寒冷和干旱胁迫下,FtANX1 mRNA积累量在12 h时表现出明显的增加,在24 h时分别进一步增加至17.39±0.24、17.6±1.60：Cu和Pb处理下,FtANX1表达量明显增加；Zn处理7d时,FtANX1表达量增加,但14d时其表达量急剧下降；Fe和Cd处理7d时, FtANX1 mRNA积累量下降,14d时其积累量增加,且Cd处理下其积累量增加了1倍；Ni、Mn处理导致FtANX1转录水平显著下降。本研究表明FtANX1响应苦荞幼苗多种环境胁迫。5.构建p163-GFP-FtANX1表达载体,瞬时转化烟草叶片,对苦荞膜联蛋白FtANX1进行亚细胞定位研究。结果表明FtANX1蛋白定位于细胞膜中,推测其参与细胞分化、胞外分泌等相关的生长发育过程。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q945.78;Q943.2
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 苦荞简介
    1.2 植物膜联蛋白简介
        1.2.1 植物中膜联蛋白的发现
        1.2.2 植物膜联蛋白的结构及分布
        1.2.3 植物细胞中膜联蛋白的功能
    1.3 植物蛋白质的亚细胞定位简介
    1.4 高等植物启动子简介
        1.4.1 启动子的概念
        1.4.2 启动子的基本结构及功能
        1.4.3 启动子的克隆
    1.5 研究目的及意义
    1.6 技术路线图
第二章 苦荞膜联蛋白基因及启动子的克隆与序列分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基
        2.1.5 方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 苦荞总DNA的提取
        2.2.2 苦荞总RNA的提取
        2.2.3 苦荞FtANX1基因的克隆
        2.2.4 苦荞FtANX1基因启动子的克隆
        2.2.5 苦荞FtANX1基因序列分析
        2.2.6 苦荞FtANX1基因启动子序列分析
    2.3 讨论
第三章 苦荞膜联蛋白基因表达模式分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 FtANX1基因组织特异性表达分析
        3.2.2 FtANX1基因响应环境胁迫表达分析
    3.3 讨论
第四章 苦荞膜联蛋白FtANX1亚细胞定位
    4.1 材料与方法
        4.1.1 植株与试剂
        4.1.2 培养基
        4.1.3 方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 GFP融合表达载体的构建
        4.2.2 重组载体在烟草中的瞬时表达
    4.3 讨论
结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文

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本文编号：2893944