唐菖蒲伯克氏菌ATCC10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘
发布时间：2020-12-04 04:14
微生物天然产物结构类型复杂,生物活性多样,是临床、农业及畜牧业药物的重要来源,如抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂和抗虫药等。在过去的几十年中,放线菌一直是微生物天然产物的主要来源。随着基因测序技术的发展,研究者从一直被忽视的伯克氏菌中挖掘到越来越多的活性天然产物。基于“Red/ET重组工程”的多种微生物重组酶系统和基因簇异源表达平台的建立,为微生物天然产物的挖掘提供了有力的技术支撑。本研究聚焦于唐菖蒲伯克氏菌（Burkholderia gladioli）ATCC 10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘,首先建立ATCC 10248的遗传操作体系,利用该体系对6个未知的NRPS基因簇进行原位激活和失活,成功激活两个基因簇,得到多个新型脂肽类化合物;并利用Red/ET重组工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。主要研究结果如下:建立B.gladioliATCC 10248的遗传操作体系。首先测定常用抗生素对ATCC 10248的最低抑制浓度,结果表明,卡那霉素、安普霉素和庆大霉素可用于菌株遗传操作过程中的抗性筛选。然后对来源于大肠杆菌（Escherichia coli）噬菌体、铜绿假单胞菌（Pse...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：119 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程的工作原理［３，６】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ??
Ｐ重组，发生在完全的单链ＤＮＡ和双??链ＤＮＡ之间。Ｒｅｄ／ＥＴ重组酶系统还包含Ｒｅｄｙ蛋白与ＲｅｃＡ蛋白。Ｒｅｄｙ蛋白是??核酸酶ＲｅｃＢＣＤ的抑制蛋白［７］，?ＲｅｃＡ蛋白是依赖ＡＴＰ的ＤＮＡ重组酶［８］，这两??种蛋白可以进一步提高重组效率。??Ｆｕ等人发现，Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ介导线性ＤＮＡ分子和环状ＤＮＡ分子之间发生同??源重组的效率要高于ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ，而ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ介导两个线性ＤＮＡ分子之间的??同源重组效率要高于Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ。由此衍生出两种同源重组类型（图１－２），即??Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ?介导的线环重组（Ｌｉｎｅａｒ－ｃｉｒｃｕｌａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＬＣＨＲ）??和?ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ?介导的线线重组（Ｌｉｎｅａｒ－ｌｉｎｅａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＬＬＨＲ）??［９］??ｏ??ｃｍ??／?ｍｍｍｍｍ——＾??ｐｌ５Ａ－ｃｍ?（２?ｋｂ）?＾??＾??０５么?＾?ｐ！５Ａ－ｃｍ?（２?ｋｂ）??十?十??ｋａｎ?＾?＿?ｋａｔｉ??ＰＣＲ?（２?ｋｂ）?ＰＣＲ（２ｋｂ）??Ｐ】５Ａ?ｃｔｎ?ｐｌ５Ａ?ａｎ??厂■■■■■■￣■■■■■■＞??ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?｜??，??ｋａｎ??Ｊ?ｍｎｍａ，＼ｗｍ????ＬＣＨＲ?ＬＬＨＲ??图１－２?Ｒｅｄ／ＥＴ介导的ＬＣＨＲ和ＬＬＨＲ示意图［９】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?ＬＣＨＲ?ａｎｄ?ＬＬＨＲ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?Ｒｅｄ／ＥＴ??Ｒｅｄ／ＥＴ重组系统发生同源重组只需要
２．１?Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程在其他细菌中的应用??目前，Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程己经成功应用于痢疾杆菌［１２］、鼠??伤寒沙门氏菌（＊Ｓ＾／？ｈｏ；叱／／ａ?［１３］、根癌农杆菌（ＪｇｒｏＡａｃｆｅｒｆｗ／Ｈ??＿等与五．ｃ〇／ｆ亲缘关系较近的革兰氏阴性菌，可以对染色体ＤＮＡ或质粒ＤＮＡ??进行快速修饰。??对于Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程使用受限的見ｃｏ／／远缘菌株而言，可以依据Ｒｅｄ／ＥＴ??重组酶系统的建立方法，在其他细菌基因组或噬菌体上寻找类似的重组蛋白对，??建立相应的重组酶系统（图１－３）。Ｙｉｎ等人在铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｗｔ／ｏｍｏｍｗ??难菌体Ａｂ３１中发现了一对重组酶，由此构建了?ＧＢＡＳ重组系统［１５］，??可以在部分假单胞菌和伯克氏菌中介导同源重组。ｇ表示来源于五．ｃｏ／／噻菌体入??的Ｒｅｄｙ蛋白，ＢＡＳ表示来源于Ｐ?ａｅｒｗｇ＇／ｎａｓ＇ｆｌ嗤菌体Ａｂ３１的蛋白，其中Ｂ与??Ｒｅｄｐ蛋白同源，具有ＤＮＡ单链结合蛋白活性，Ａ与Ｒｅｄａ蛋白同源，具有５＇－３＇??核酸外切酶活性，Ｓ为另一种单链结合蛋白，与五．ｃｏ／／中的单链结合蛋白同源。??Ｃｈｅｎ等人利用ＧＢＡＳ重组系统，在５．?ＨＫＩ?４５４中挖掘到多个活性天??然产物［１６］。２０１８年，Ｗａｎｇ等人从７０２９?（现重新分类为??ｔｖｄ?；？?Ｊｖｄ?Ｐ?ｒｅｄ?ａ?＞ｖｄ?；？?ｔｖｅｉ?￥?＞ｖｄ?ａ??Ｅ．?ｃｏ／ｉ?ｒｅｄｙＰａ??丨?：ｌ?＂?Ｅ．?ｃｏｌｉ?ｒｅｄｙｐａ?—ｉ＾ＣＺＺ＾ＸｎｉＪ）???伯克氏菌一?＾＾為―＝１＾＾＜一??构建表达质粒?构建表达质粒??ｔｖｄ／?＞ｖｄａ?７０２９??Ｒｅｄｙ－Ｒｅｄａｐ７
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制研究进展[J]. 徐超奕,张婷,蔡静晓,余志良,裘娟萍,音建华. 生物工程学报. 2018(08)
[2]Red/ET同源重组技术及其在微生物基因组挖掘中的应用进展[J]. 郑文韬,张友明,卞小莹. 微生物学报. 2017(11)
[3]细菌Ⅲ型聚酮合酶研究进展[J]. 苏世友,滕超,张维,陈明. 中国农业科技导报. 2013(06)
[4]非核糖体肽合成酶结构研究进展[J]. 李红玲. 临床合理用药杂志. 2013(28)
[5]非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化[J]. 方剑,朱鹏,严小军. 中国生物化学与分子生物学报. 2013(07)
[6]非核糖体肽合成酶主要结构域的研究进展[J]. 郑宗明,顾晓波,俞海青,梁凤来,刘如林. 中国抗生素杂志. 2005(02)
[7]Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究[J]. 胡堃,史兆兴,王恒樑,冯尔玲,黄留玉. 微生物学报. 2003(06)
本文编号：2896998
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：119 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程的工作原理［３，６】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ??
Ｐ重组，发生在完全的单链ＤＮＡ和双??链ＤＮＡ之间。Ｒｅｄ／ＥＴ重组酶系统还包含Ｒｅｄｙ蛋白与ＲｅｃＡ蛋白。Ｒｅｄｙ蛋白是??核酸酶ＲｅｃＢＣＤ的抑制蛋白［７］，?ＲｅｃＡ蛋白是依赖ＡＴＰ的ＤＮＡ重组酶［８］，这两??种蛋白可以进一步提高重组效率。??Ｆｕ等人发现，Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ介导线性ＤＮＡ分子和环状ＤＮＡ分子之间发生同??源重组的效率要高于ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ，而ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ介导两个线性ＤＮＡ分子之间的??同源重组效率要高于Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ。由此衍生出两种同源重组类型（图１－２），即??Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ?介导的线环重组（Ｌｉｎｅａｒ－ｃｉｒｃｕｌａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＬＣＨＲ）??和?ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ?介导的线线重组（Ｌｉｎｅａｒ－ｌｉｎｅａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＬＬＨＲ）??［９］??ｏ??ｃｍ??／?ｍｍｍｍｍ——＾??ｐｌ５Ａ－ｃｍ?（２?ｋｂ）?＾??＾??０５么?＾?ｐ！５Ａ－ｃｍ?（２?ｋｂ）??十?十??ｋａｎ?＾?＿?ｋａｔｉ??ＰＣＲ?（２?ｋｂ）?ＰＣＲ（２ｋｂ）??Ｐ】５Ａ?ｃｔｎ?ｐｌ５Ａ?ａｎ??厂■■■■■■￣■■■■■■＞??ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?｜??，??ｋａｎ??Ｊ?ｍｎｍａ，＼ｗｍ????ＬＣＨＲ?ＬＬＨＲ??图１－２?Ｒｅｄ／ＥＴ介导的ＬＣＨＲ和ＬＬＨＲ示意图［９】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?ＬＣＨＲ?ａｎｄ?ＬＬＨＲ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?Ｒｅｄ／ＥＴ??Ｒｅｄ／ＥＴ重组系统发生同源重组只需要
２．１?Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程在其他细菌中的应用??目前，Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程己经成功应用于痢疾杆菌［１２］、鼠??伤寒沙门氏菌（＊Ｓ＾／？ｈｏ；叱／／ａ?［１３］、根癌农杆菌（ＪｇｒｏＡａｃｆｅｒｆｗ／Ｈ??＿等与五．ｃ〇／ｆ亲缘关系较近的革兰氏阴性菌，可以对染色体ＤＮＡ或质粒ＤＮＡ??进行快速修饰。??对于Ｒｅｄ／ＥＴ重组工程使用受限的見ｃｏ／／远缘菌株而言，可以依据Ｒｅｄ／ＥＴ??重组酶系统的建立方法，在其他细菌基因组或噬菌体上寻找类似的重组蛋白对，??建立相应的重组酶系统（图１－３）。Ｙｉｎ等人在铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｗｔ／ｏｍｏｍｗ??难菌体Ａｂ３１中发现了一对重组酶，由此构建了?ＧＢＡＳ重组系统［１５］，??可以在部分假单胞菌和伯克氏菌中介导同源重组。ｇ表示来源于五．ｃｏ／／噻菌体入??的Ｒｅｄｙ蛋白，ＢＡＳ表示来源于Ｐ?ａｅｒｗｇ＇／ｎａｓ＇ｆｌ嗤菌体Ａｂ３１的蛋白，其中Ｂ与??Ｒｅｄｐ蛋白同源，具有ＤＮＡ单链结合蛋白活性，Ａ与Ｒｅｄａ蛋白同源，具有５＇－３＇??核酸外切酶活性，Ｓ为另一种单链结合蛋白，与五．ｃｏ／／中的单链结合蛋白同源。??Ｃｈｅｎ等人利用ＧＢＡＳ重组系统，在５．?ＨＫＩ?４５４中挖掘到多个活性天??然产物［１６］。２０１８年，Ｗａｎｇ等人从７０２９?（现重新分类为??ｔｖｄ?；？?Ｊｖｄ?Ｐ?ｒｅｄ?ａ?＞ｖｄ?；？?ｔｖｅｉ?￥?＞ｖｄ?ａ??Ｅ．?ｃｏ／ｉ?ｒｅｄｙＰａ??丨?：ｌ?＂?Ｅ．?ｃｏｌｉ?ｒｅｄｙｐａ?—ｉ＾ＣＺＺ＾ＸｎｉＪ）???伯克氏菌一?＾＾為―＝１＾＾＜一??构建表达质粒?构建表达质粒??ｔｖｄ／?＞ｖｄａ?７０２９??Ｒｅｄｙ－Ｒｅｄａｐ７
【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制研究进展[J]. 徐超奕,张婷,蔡静晓,余志良,裘娟萍,音建华. 生物工程学报. 2018(08)
[2]Red/ET同源重组技术及其在微生物基因组挖掘中的应用进展[J]. 郑文韬,张友明,卞小莹. 微生物学报. 2017(11)
[3]细菌Ⅲ型聚酮合酶研究进展[J]. 苏世友,滕超,张维,陈明. 中国农业科技导报. 2013(06)
[4]非核糖体肽合成酶结构研究进展[J]. 李红玲. 临床合理用药杂志. 2013(28)
[5]非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化[J]. 方剑,朱鹏,严小军. 中国生物化学与分子生物学报. 2013(07)
[6]非核糖体肽合成酶主要结构域的研究进展[J]. 郑宗明,顾晓波,俞海青,梁凤来,刘如林. 中国抗生素杂志. 2005(02)
[7]Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究[J]. 胡堃,史兆兴,王恒樑,冯尔玲,黄留玉. 微生物学报. 2003(06)
本文编号：2896998
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