单细胞测序技术研究FGFR3负调控小鼠造血干细胞增殖的分子机制

发布时间：2020-12-12 03:48

　　背景和目的:造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）具有自我更新和多向分化的潜能,目前很多血液系统恶性疾病有效的治疗方法是造血干细胞移植。脐带血由于其免疫原性较弱的特点也成为造血干细胞移植的来源。虽然有很多扩增HSCs的方法,但是都难以满足临床治疗的需要。因此如何大量扩增HSCs,特别是脐带血干细胞是我们目前亟待解决的问题。有研究报道FGF1和FGF2可以在体外扩增HSCs,也有研究阐明了骨髓损伤修复过程中FGFR1促进HSCs增殖。FGF家族的四个受体中FGFR1和FGFR3都在HSCs中高表达,而前期本实验室已经通过体内实验证实FGFR3能负调控骨髓损伤条件下的HSCs增殖,那么FGFR3对HSCs的体外扩增有什么调控作用呢?本文以此为出发点,探讨FGFR3对HSCs体外增殖的调控作用及其分子机制。方法:1.利用流式细胞仪,从已建立的Fgfr3敲除小鼠中,分离造血干细胞（Flk2-LSK）,运用RNA-seq技术进行了单细胞测序,对差异表达基因进行了系统的分析。2.通过细胞的体外培养实验,利用流式细胞术分析了不同生长因子对WT和KO小鼠的HSCs体外... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词汇
第1章 绪论
    1.1 HSCs的概述
    1.2 HSCs的应用
    1.3 FGFs家族在造血中的作用
    1.4 FGFs家族在血液肿瘤中的作用
    1.5 FGFR3概述
        1.5.1 FGFR3与骨骼疾病
        1.5.2 FGFR3与癌症
    1.6 本课题的研究思路
第2章 材料和方法
    2.1 仪器与试剂
        2.1.1 主要的试剂
        2.1.2 抗体
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 实验试剂的配方
        2.1.5 实验动物
    2.2 实验方法
        2.2.1 小鼠基因型鉴定
        2.2.2 蛋白水平验证基因敲除小鼠FGFR3表达情况
        2.2.3 分离小鼠骨髓细胞
        2.2.4 免疫磁珠法分选小鼠CD117+造血干/祖细胞
        2.2.5 免疫磁珠法分选小鼠LK造血祖细胞
        2.2.6 流式细胞术分析HSCs胞内蛋白的表达
        2.2.7 细胞体外培养并检测HSCs的比例
        2.2.8 病毒侵染CD117+造血干/祖细胞
        2.2.9 AnnexinV检测细胞凋亡
        2.2.10 BrdU检测细胞增殖
第3章 实验结果
    3.1 小鼠基因型鉴定结果
        3.1.1 通过PCR方法扩增Fgfr3基因片段的结果
        3.1.2 PCR产物测序结果
        3.1.3 蛋白水平验证FGFR3在小鼠体内的敲除情况
    3.2 单细胞测序检测FGFR3对HSCs中基因表达的影响
    3.3 PDGFR的表达检测结果
    3.4 FGF2/PDGF促进FGFR3敲除的HSCs增殖
    3.5 PDGF-BB通过激活STAT5和上调CyclinD1的表达促进HSCs扩增
    3.6 FGFR3通过激活STAT1负调控HSCs扩增
    3.7 si-Stat5a病毒侵染CD117+细胞
        3.7.1 RT-PCR法验证Stat5基因表达情况
        3.7.2 si-Stat5a病毒侵染CD117+细胞的荧光变化情况
        3.7.3 AnnexinV检测细胞凋亡情况
        3.7.4 BrdU检测细胞的增殖能力
    3.8 FGFR3-K650E病毒侵染CD117+细胞
        3.8.1 蛋白水平验证FGFR3-K650E的表达情况
        3.8.2 AnnexinV检测细胞凋亡情况
        3.8.3 BrdU检测细胞增殖能力
        3.8.4 CD117+细胞内信号通路蛋白的表达及活化情况
第4章 实验结论
第5章 实验讨论
参考文献
致谢



本文编号：2911801