基因编辑技术在甾醇代谢途径关键基因再解析中的应用
发布时间：2020-12-12 22:30
甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物,具有重要的生理活性,在临床上有广泛的应用。许多分枝杆菌可以使用低附加值的甾醇作为碳源和能源来生产甾体激素药物成分或前体,因此,修饰或改造分枝杆菌代谢途径以积累高附加值甾体中间体是甾体制药工业半合成路线中最重要的一步。甾醇氧化过程在分枝杆菌中高度保守,通过对甾体多环或侧链的一些生物转化,可以得到许多有价值的药物中间体,如C19类固醇雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）以及C22类固醇20-羟甲基孕甾-4-烯-3-酮（4-HBC）。本论文利用一系列基因编辑技术改造实验室现有菌种,获得可以大量积累AD和9α-OH-AD的工程菌。首先利用CRISPR-dCas9构建了抑制Mn-AD中hsd4A表达的菌株,同时抑制Mycobacterium neoaurum 2967（M.neoaurum 2967）中hsd4A 和kstD表达的菌株,以及利用CRISPR-Cas12a构建了耻垢分枝杆菌mc2155（M.smegmatis mc2155）中kstD1的...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２部分甾体药物中间体的结构??１．１．４甾醇及甾醇代谢的分子机制??
?甾酮－４－烯结构之后由细胞色素Ｐ４５０?（ｃｙｐｌ２５或／和ｃｙｐｌ４２）催化侧链末端氧??化，生成末端带有轻基或竣基的物质，再经甾醇辅酶Ａ连接酶（ｓｔｅｒｏｌ－ＣｏＡｌｉｇａｓｅｓ）、??脱氢酶（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）、水合酶（ｈｙｄｒａｔａｓｅｓ）以及酰基辅酶Ａ硫解酶（ａｃｙｌ－??ＣｏＡｔｈｉｏｌａｓｅｓ）催化后，脱去一分子丙酰辅酶Ａ生成一种Ｃ２４羧酸物质。经过三??轮类似的Ｐ－氧化留醇侧链完全降解，产生ＡＤ中间体以及一个乙酰辅酶Ａ和两??个丙酰辅酶Ａ分子［２４１?（图１．３）。??＇广八，ｃｈ２ｏｈ??ｒ?斗、、?Ｃ］＇＇??丫?３Ｐ－ＨＳＤ?Ｃｙｐ１２５／Ｃｙｐ１４２?，，、｜．－丄＇＇，丄－－’＇??Ｈｃｊ’、＇＇入’?ＣｈＯｘ?、夕、」??Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ?２６－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ??Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ??，ｒｔ＞ｌ??。切?－Ｄ。．以Ｊ?＾??〇政１??９－ＯＨ－ＡＤＤ?ＡＤ??Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ－２６－ｏｉｃ?ａｃｉｄ??Ｎｏ?ｅｎｚｙｍａｔｉｃ??。冰?ｘ６?ｒ＇Ｈ??ＨｓａＡＢ?ＦａｄＤ３?〇?—??ｒ?二?ｃ〇２＋ｈ２〇??Ｈ〇ｘｒ?人＾??３－ＨＳＡ?ＨＩＰ?ＨＩＰ－ＣｏＡ??图１．３胆固醇可能的降解途径??４??
氢反应生产氢化泼尼龙等具有抗炎作用的肾上??腺皮质激素和高附加值的留体药物［７］。利用化学方法也能进行２位的脱氢反应，??但化学法通常有产物毒性大、环境污染等缺点，微生物转化则能较好地取长补短，??在甾体抗炎激素类药物合成中扮演着重要的角色。??２．?３－甾酮－Ａ１－脱氢酶??甾酮?Ｃｉ，２?位脱氢酶，也称?３－甾酮－Ａ１－脱氢酶Ｇ－ｋｅｔｏｓｔｅｒｏｉｄ－Ａ＾ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，??ＫｓｔＤ），是甾体母核降解的关键酶，能催化３－甾酮化合物在甾体母核Ａ环的ＣＵ??位处脱氢（图１．４）。不同微生物中的３－留酮－Ａ１－脱氢酶并不完全相同［４（ｙｌ，不同菌??种来源的３－留酮－Ａ１－脱氢酶也有很多相似性［７］。??．〇?．?，０??＋．々?ＫｓｔＤ?ｒ，＇．＇４－??ｒ十．丄丫上？，?＾??？人＾＾?０人入」??ＡＴ）?ＡＤＤ??图１．４甾体化合物位脱氢基本反应式??５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限[J]. 吴言,郝雅荞,韦璇,沈琦,柳叶飞,王升厚,赵洪新. 生物技术通报. 2018(05)
[2]基因组编辑工具的新晋“黑马”:FnCpf1在人类细胞内具备有效基因组编辑活性[J]. 谷峰. 遗传. 2017(10)
[3]3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备[J]. 袁家代,陈贵英,程世君,葛方兰,王琼,李维,李江. 生物工程学报. 2015(04)
[4]分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01 3-甾酮-9α-羟基化酶基因的克隆、异源表达及分离纯化[J]. 范书玥,魏巍,王风清,魏东芝. 生物工程学报. 2009(12)
博士论文
[1]分枝杆菌甾醇代谢机制的解析以及其代谢工程改造应用于制备重要甾药中间体的研究[D]. 姚抗.华东理工大学 2014
[2]Mycobacterium neoaurum NwIB-01降解甾醇母核关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶和3-甾酮-9α-羟化酶基因的鉴定及其基因工程改造[D]. 魏巍.华东理工大学 2010
硕士论文
[1]分枝菌酸缺失对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的影响研究[D]. 高云飞.江南大学 2018
[2]谷氨酸棒杆菌分枝菌酸的提取、纯化及结构分析[D]. 杨扬.江南大学 2012
[3]转化植物甾醇为雄甾烯酮菌株的筛选鉴定及发酵工艺的研究[D]. 廖伟宏.江南大学 2008
[4]分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究[D]. 杜蓉.广东药学院 2008
本文编号：2913386
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２部分甾体药物中间体的结构??１．１．４甾醇及甾醇代谢的分子机制??
?甾酮－４－烯结构之后由细胞色素Ｐ４５０?（ｃｙｐｌ２５或／和ｃｙｐｌ４２）催化侧链末端氧??化，生成末端带有轻基或竣基的物质，再经甾醇辅酶Ａ连接酶（ｓｔｅｒｏｌ－ＣｏＡｌｉｇａｓｅｓ）、??脱氢酶（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）、水合酶（ｈｙｄｒａｔａｓｅｓ）以及酰基辅酶Ａ硫解酶（ａｃｙｌ－??ＣｏＡｔｈｉｏｌａｓｅｓ）催化后，脱去一分子丙酰辅酶Ａ生成一种Ｃ２４羧酸物质。经过三??轮类似的Ｐ－氧化留醇侧链完全降解，产生ＡＤ中间体以及一个乙酰辅酶Ａ和两??个丙酰辅酶Ａ分子［２４１?（图１．３）。??＇广八，ｃｈ２ｏｈ??ｒ?斗、、?Ｃ］＇＇??丫?３Ｐ－ＨＳＤ?Ｃｙｐ１２５／Ｃｙｐ１４２?，，、｜．－丄＇＇，丄－－’＇??Ｈｃｊ’、＇＇入’?ＣｈＯｘ?、夕、」??Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ?２６－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ??Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ??，ｒｔ＞ｌ??。切?－Ｄ。．以Ｊ?＾??〇政１??９－ＯＨ－ＡＤＤ?ＡＤ??Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ－２６－ｏｉｃ?ａｃｉｄ??Ｎｏ?ｅｎｚｙｍａｔｉｃ??。冰?ｘ６?ｒ＇Ｈ??ＨｓａＡＢ?ＦａｄＤ３?〇?—??ｒ?二?ｃ〇２＋ｈ２〇??Ｈ〇ｘｒ?人＾??３－ＨＳＡ?ＨＩＰ?ＨＩＰ－ＣｏＡ??图１．３胆固醇可能的降解途径??４??
氢反应生产氢化泼尼龙等具有抗炎作用的肾上??腺皮质激素和高附加值的留体药物［７］。利用化学方法也能进行２位的脱氢反应，??但化学法通常有产物毒性大、环境污染等缺点，微生物转化则能较好地取长补短，??在甾体抗炎激素类药物合成中扮演着重要的角色。??２．?３－甾酮－Ａ１－脱氢酶??甾酮?Ｃｉ，２?位脱氢酶，也称?３－甾酮－Ａ１－脱氢酶Ｇ－ｋｅｔｏｓｔｅｒｏｉｄ－Ａ＾ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，??ＫｓｔＤ），是甾体母核降解的关键酶，能催化３－甾酮化合物在甾体母核Ａ环的ＣＵ??位处脱氢（图１．４）。不同微生物中的３－留酮－Ａ１－脱氢酶并不完全相同［４（ｙｌ，不同菌??种来源的３－留酮－Ａ１－脱氢酶也有很多相似性［７］。??．〇?．?，０??＋．々?ＫｓｔＤ?ｒ，＇．＇４－??ｒ十．丄丫上？，?＾??？人＾＾?０人入」??ＡＴ）?ＡＤＤ??图１．４甾体化合物位脱氢基本反应式??５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限[J]. 吴言,郝雅荞,韦璇,沈琦,柳叶飞,王升厚,赵洪新. 生物技术通报. 2018(05)
[2]基因组编辑工具的新晋“黑马”:FnCpf1在人类细胞内具备有效基因组编辑活性[J]. 谷峰. 遗传. 2017(10)
[3]3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备[J]. 袁家代,陈贵英,程世君,葛方兰,王琼,李维,李江. 生物工程学报. 2015(04)
[4]分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01 3-甾酮-9α-羟基化酶基因的克隆、异源表达及分离纯化[J]. 范书玥,魏巍,王风清,魏东芝. 生物工程学报. 2009(12)
博士论文
[1]分枝杆菌甾醇代谢机制的解析以及其代谢工程改造应用于制备重要甾药中间体的研究[D]. 姚抗.华东理工大学 2014
[2]Mycobacterium neoaurum NwIB-01降解甾醇母核关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶和3-甾酮-9α-羟化酶基因的鉴定及其基因工程改造[D]. 魏巍.华东理工大学 2010
硕士论文
[1]分枝菌酸缺失对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的影响研究[D]. 高云飞.江南大学 2018
[2]谷氨酸棒杆菌分枝菌酸的提取、纯化及结构分析[D]. 杨扬.江南大学 2012
[3]转化植物甾醇为雄甾烯酮菌株的筛选鉴定及发酵工艺的研究[D]. 廖伟宏.江南大学 2008
[4]分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究[D]. 杜蓉.广东药学院 2008
本文编号：2913386
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