柘树果实抗氧化成分分析及其异黄酮Scandenolone诱导乳腺癌细胞凋亡通路研究

发布时间：2017-10-29 22:41

  本文关键词：柘树果实抗氧化成分分析及其异黄酮Scandenolone诱导乳腺癌细胞凋亡通路研究

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【摘要】：目的：运用多种分离设备对柘果的抗氧化成分进行提取、分离、纯化,核磁和液质联用设备进行结构鉴定,得到柘果中的化合物。从细胞凋亡通路着手,分析异黄酮Scandenolone对乳腺癌细胞M231的抑制机理。通过一系列的研究,从而得到柘果的指纹图谱,进一步得到柘果的药用价值及其相应的作用机制。方法：(1)首先通过乙醇浸提柘树果实,然后进行大孔树脂和十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)分离柱柱分离,最后运用制备液相设备得到柘树果实中的抗氧化成分单体,用液质联用仪和核磁等手段进行单体结构的确定。(2)MTT检测异黄酮Scandenolone对M231细胞生长影响：原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)观察异黄酮Scandenolone对M231细胞形态的影响；流式细胞术(flow cytometry, FCM)观察异黄酮Scandenolone对M231细胞周期的影响；FCM观察异黄酮Scandenolone对M231细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)的影响；荧光酶标仪检测异黄酮Scandenolone对M231细胞活性氧(reactie oxygen species, ROS)水平影响；Western blot测定异黄酮Scandenolone对M231细胞信号通路蛋白表达的影响,蛋白包括：casepase-3, PARP, Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bad, (p)-p53, (p)-JNK, (p)-ERK, (p)-AKT, (p)-p38, GADPHc结果：(1)经过大孔树脂柱分离后,得到4部分粗提物,分别是30%-乙醇粗提物(2.8g),50%-乙醇粗提物(4.0g),75%-乙醇粗提物(3.7g),95%-乙醇粗提物(0.3g)。将4部分粗提物进行抗氧化能力分析,发现75%-乙醇部分抗氧化能力最强,进一步分离纯化得到13个单体,其中4个已经得到其具体结构,分别为：Arctiin, erythrivarone A, 2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-c-butyrolactone, lappaol F。(2) Scandenolone可明显的抑制乳腺癌细胞M231的生长,当用20ug/mL浓度的Scandenolone作用细胞72h后,细胞几乎完全停止生长,选定3个浓度(10,12.5,15ug/ml)进行后续实验；AFM结果,Scandenolone作用细胞24h后,发现随浓度的增大,细胞形状逐渐从菱形变为圆形,且细胞体积逐渐缩小,并从壁上脱落。FCM结果,引起Sub-G1凋亡峰百分数急剧增加,由低浓度组(10ug/ml)的17.9%上升到高浓度组(15ug/ml)的99.3%,同对照组比所有作用浓度均有统计学差异(P0.05),而在Scandenolone作用下,G0/G1,S和G2/M峰没受多大影响,且随着药物浓度的增加,线粒体膜电位下降。荧光酶标仪检测结果,随着药物浓度增加,ROS含量会升高,当处理时间为30mmin时,ROS含量上升到最大,随后趋于稳定。western blot结果,不同浓度Scandenoloneon作用M231细胞24 h后,各刺激组casepase-3表达量降低,并且给药组同对照组相比都具有统计学意义(P0.05), PARP表达量也明显降低,给药组同对照组比都具有统计学意义(P0.001)；随着Scandenolone剂量的增加,在总的p53蛋白水平变化不大(P0.05),而p53的磷酸化增加,给药组同同对照组比都具有统计学意义(P0.001)：上调Bax和Bcl-2的表达,但是Bax/Bcl-2的比值随着Scandenolone的浓度增加而呈剂量效应的下降(P0.001),而对Bad、Bcl-xl蛋白的表达无显著影响；随着Scandenoloneon剂量的增加,在总的p38 MAPKs蛋白水平保持不变的情况下(P0.05),而p38 MAPKs的磷酸化水平随剂量的增加而增加,给药组同同对照组比具有统计学意义(P0.01),除低剂量组(0.5ug/ml)例外。而AKT, ERK, JNK三个激酶磷酸化水平基本没变。结论：(1)得到4个化合物的结构,它们是Arctiin, erythrivarone A, 2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-c-butyrolactone, lappaol F。(2) Scandenolone具有抗乳腺癌活性,其凋亡通路为：Scandenolone刺激细胞的ROS含量增高,引起细胞的氧化损伤,进而抑制AKT、ERK口JNK的磷酸化,导致p38和p53的活化,线粒体膜电位降低和Bcl-2家族的表达改变,最终激活凋亡执行蛋白casepase-3,引发M231细胞发生凋亡。
【关键词】：柘树果实 分离 提取 结构鉴定 Scandenolone MMP ROS 细胞凋亡通路 M231
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.4
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词8-11
• 1 前言11-17
• 1.1 柘树研究现状11-15
• 1.1.1 化学成分研究11-12
• 1.1.2 活性成分药理研究12-15
• 1.2 柘树果实研究现状15-16
• 1.3 乳腺癌概述16
• 1.4 本研究的目的和意义16-17
• 1.5 研究内容17
• 2 材料与方法17-30
• 2.1 实验材料17-21
• 2.1.1 实验材料17
• 2.1.2 主要仪器17-18
• 2.1.3 主要试剂18-21
• 2.2 实验方法21-30
• 2.2.1 柘果抗氧化成分的提取与分离21-26
• 2.2.2 异黄酮SCANDENOLONE对乳腺癌细胞M231作用机制研究26-30
• 3 结果与讨论30-59
• 3.1 柘果抗氧化成分的分离、提取、纯化及结构鉴定30-49
• 3.1.1 抗氧化部分确定30-32
• 3.1.2 化合物结构解析32-48
• 3.1.3 本节小结48-49
• 3.2 异黄酮SCANDENOLONE对乳腺癌细胞M231作用机制研究49-59
• 3.2.1 异黄酮Scandenolone对乳腺癌细胞M231生长抑制作用和试验条件49-50
• 3.2.2 FCM观察异黄酮SCANDENOLONE对M231细胞周期的影响结果50-51
• 3.2.3 FCM观察异黄酮SCANDENOLONE对M231细胞线粒体膜电位影响结果51-52
• 3.2.4 酶标仪观察异黄酮SCANDENOLONE对M231细胞ROS影响结果52-53
• 3.2.5 WESTERN BLOT测定SCANDENOLONEON对M231细胞凋亡通路的判断53-58
• 3.2.6 本节小结58-59
• 4 结论与展望59-61
• 4.1 研究结论59
• 4.1.1 柘果的抗氧化成分的分离、提取、纯化及结构鉴定59
• 4.1.2 异黄酮SCANDENOLONE对乳腺癌细胞M231作用机制研究59
• 4.2 论文的创新点59-60
• 4.3 展望60-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间发表的学术论文目录67

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1 曹春廷;柘树果实抗氧化成分分析及其异黄酮Scandenolone诱导乳腺癌细胞凋亡通路研究[D];四川农业大学;2015年

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本文编号：1114992