没食子酸脱羧酶（GAD）的分离及其酶学性质研究

发布时间：2017-11-15 14:07

  本文关键词：没食子酸脱羧酶（GAD）的分离及其酶学性质研究

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【摘要】：五倍子是中国特色林产品,常用作制备没食子酸(Gallic Acid)和焦性没食子酸(Pyrogallol)的原料。焦性没食子酸广泛应用于农药、医药、化妆品、显影剂、热敏剂、高分子材料等领域。传统上,焦性没食子酸是通过没食子酸在强酸和强碱催化下化学脱羧制得,该方法不仅产生大量高色度的废水,严重污染环境,而且产品中催化剂残留难以去除,金属杂质偏高。因此,本课题考察微生物转化没食子酸制备焦性没食子酸的新工艺研究,筛选出产没食子酸脱羧酶(Gallic Acid Decarboxylase,GAD)的高产菌株,分离纯化GAD,并初步研究了GAD的结构及其酶学性质,结果表明利用微生物降解没食子酸制备焦性没食子酸具有广阔的发展前景。论文选择特定的培养基(即CDM培养基,由0.06%Mg SO4·7H2O、0.4%(NH4)2SO4、0.2%没食子酸及30 mmol·L-1 p H为6.6的磷酸盐缓冲溶液组成),以没食子酸作为唯一碳源进行底物诱导48 h,通过发酵液中没食子酸降解率和焦性没食子酸产率的变化,从肠杆菌属(Enterobacter Spp.,E.Spp.)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter Spp.,C.Spp)中筛选出产GAD的产气肠杆菌(Enterobacter Aerogenes,E.Aerogenes)CICC23008,然后通过6个单因素的考察及响应面优化,确定优化工艺条件为接种量5%,底物浓度0.4%,磷酸盐缓冲溶液含量25%(p H为6.6),发酵温度32℃,发酵液初始p H=6,底物质量分数0.32%,焦性没食子酸平均收率为77.86%。论文重点研究了GAD的分析方法、提取和分离工艺及结构表征。建立了考马斯亮蓝法测定GAD蛋白含量线性方程(Y=4.8485X+0.4865,R2=0.9943)和双缩脲法测GAD蛋白含量线性方程(Y=0.2476X+0.0003,R2=0.9993)。对E.Aerogenes在优化条件下产生的GAD粗酶液,分别采用p H为6浓度为60%和70%的硫酸铵盐沉淀32 h时效果最好;然后,采用80 k D透析膜进行透析纯化,若500 m L料液则膜处理时间12~16 h,透析效果较好;再将透析液经二乙氨基乙基(Diethyl Aminoethanol,DEAE)纤维素树脂分离纯化GAD蛋白,DEAE在p H为6.5时对GAD的静态吸附的饱和吸附量可达2.838 mg·g-1;在p H=7.5时采用0.4 mol·L-1 Na Cl溶液进行洗脱,洗脱液再利用G-75和G-100葡聚糖凝胶纯化GAD蛋白样品,蛋白质含量为59.3%,最大吸收波长为225 nm。采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳分离得到蛋白样品条带belt1,采用MALDI-TOF-TOF-MS技术对belt1蛋白条带进行结构表征,结果表明belt1蛋白分子质量45.62 k D,等电点5.19,与已知蛋白质gi/334732950匹配度为53,说明两者具有相似性,但匹配到的序列组仅占蛋白全序列的3%,因此初步推测蛋白质gi/334732950可能是belt1蛋白带的一个主要的肽段,GAD可能是一种新的酶。论文初步研究了GAD的酶专一性和酶活性质,结果表明,GAD对没食子酸具有较强的专一性,能够较为专一的降解没食子酸。选择GAD含量为5 mg·m L-1,没食子酸浓度为0.4 mg·m L-1,发酵温度为35℃,磷酸盐缓冲溶液的p H为6.0时对GAD酶活力的促进作用最强,而金属离子对酶活力的促进作用强弱为Mg2+Sn2+Cu2+Zn2+K+Ca2+Fe2+,添加剂对酶活力的抑制作用强弱为EDTASDSTriton X-100Tween 20。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O629.8

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本文编号：1190034