猪小肠黏膜肝素加工废弃物中黏蛋白的提取分离、结构表征及免疫活性评价

发布时间：2018-05-15 21:30

  本文选题：猪小肠粘膜 + 黏蛋白　； 参考：《中国海洋大学》2015年硕士论文

【摘要】：本文以猪小肠黏膜肝素加工废弃物为原料,分别采用60℃热水、胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、2709碱性蛋白酶(CAS：9014-01-1)、胃蛋白酶(CAS：9001-75-6)和枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.14)提取共获得5种黏蛋白粗品,Ims-W、Ims-Y、 Ims-YJ、Ims-A和Ims-N。它们的收率分别为0.30%、1.21%、4.03%、0.34%及1.22%。对5种黏蛋白粗品的基本理化性质进行分析,并采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对其单糖组成进行测定。结果表明,Ims-W、Ims-Y、Ims-YJ、Ims-A和Ims-N的重均分子量分别为1371kDa、1028kDa、665 kDa、684 kDa和839 kDa,蛋白含量分别为51.23%、27.24%、36.97%、56.78%和44.21%,硫酸根含量均低于5%。单糖组成分析表明5种黏蛋白粗品主要由氨基半乳糖(GalN)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)组成。因提取工艺不同,样品中的唾液酸含量差别较大,NeuAc和NeuGc的含量一般在2.91%～17.58%及4.61%～12.71%之间。对酶提样品Ims-Y和Ims-YJ进一步纯化并借助质谱手段进行结构表征。根据电荷密度分布不同,采用强阴离子交换层析从Ims-Y和Ims-YJ粗品中共得到六个纯化组分,即Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0,它们的收率分别为73.21%、3.22%、5.35%、83.33%、1.67%和2.89%。理化性质分析结果表明,Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0的蛋白含量分别为20.34%、30.91%、10.90%、31.06%、10.78%和13.96%,硫酸根含量分别为3.43%、8.71%、13.92%、3.16%、9.13%和17.21%,重均分子量分别为763 kDa、24 kDa、31 kDa、658 kDa、21 kDa和22 kDa。RP-HPLC单糖组成分析表明,Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0中均主要由GalN、GIcN、Gal和Fuc组成,其中Ims-Y-1.0和Ims-YJ-1.0还含有13%～16%的葡萄糖醛酸(GlcA)。此夕,Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6均含NeuGc和NeuAc,且它们的含量在11.82%～36.14%之间,而另外4个组分则不含NeuGc和NeuAc。进一步对黏蛋白Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6结构分析,首先采用还原β-消除法对Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6进行O-糖链释放,然后选择Bio-gel P2凝胶渗透色谱对释放的寡糖醇混合物进行分离。根据Bio-gel P2纯化结果,采用电喷雾碰撞诱导串联质谱(ESI-CID-MS/MS)技术对Ims-Y-0.6中释放的寡糖进行二级质谱分析。结合文献中关于O-糖链结构解析质谱规律,利用特征离子,从核心结构类型,硫酸根、唾液酸、岩藻糖取代位置以及连接方式等方面确定了26个O-糖链结构,表明该样品为高唾液酸化、GlcNAc C-6位硫酸根取代、抗原表位主要为Blood group H型的黏蛋白。最后,本文采用Raw264.7细胞吞噬中性红实验,探讨了从猪小肠黏膜肝素加工废弃物中所获得的黏蛋白对巨噬细胞吞噬能力的影响,结果表明,在一定浓度下,该类黏蛋白可以活化巨噬细胞,促进其吞噬能力,显示了较好的免疫增强活性。以上结果为该高糖基化黏蛋白的进一步开发利用提供了有用参考。
[Abstract]:In this paper, using porcine intestinal mucosa heparin processing waste as raw material, five kinds of mucin crude products Ims-Wims-Y, Ims-YJK Ims-A and Ims-Ns were obtained by using hot water at 60 鈩，

本文编号：1894034