猪股骨降血压肽分离纯化的研究

发布时间：2017-03-26 03:04

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【摘要】：本研究采用本实验室前期研究的以猪股骨酶解的酶解液为原料,分别利用超滤、凝胶层析、离子交换层析、制备型反相高效液相色谱分离纯化技术从酶解液中分离纯化猪股骨降血压肽。采用0.22μm、0.45μm两种孔径滤膜过滤猪股骨酶解液,再利用截留分子量为5kD的超滤离心管对过滤后的酶解液进行超滤,比较两种滤膜过滤的酶解液超滤分离后滤液的色值、澄清度、蛋白得率及ACE(血管紧张素转换酶)抑制活性。研究显示：0.22μm微孔滤膜处理的酶解液超滤后的色值、澄清度效果好于0.45gm微孔滤膜,两者超滤后分子量段的ACE抑制率差异不显著,蛋白得率前者较低。将猪股骨酶解液超滤分离后5kD的酶解滤液(其IC50值为1.362mg/mL)进行凝胶层析分离,研究了洗脱液、流速、上样量三个因素对猪股骨降血压肽分离纯化效果的影响。结果表明：以去离子水为洗脱液,控制进出流速为0.6mL/min,上样量为1%时,能够得到最佳分离效果,其最高活性组分IC50值达到0.4016mg/mL。猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后,为了得到更高活性且纯度更高的降血压肽,采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱液pH、离子强度、流速三个因素进行研究,确定了最佳分离条件：以pH=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液、B液为含1mol/LNaCl的pH=6.0. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液,洗脱流速为0.8mL/min。结果显示：离子交换层析分离得3个组分,其中组分1的活性最高,其IC50值为0.1012mg/mL;离子交换层析之后得到的猪股骨降血压肽溶液含有大量的盐类,再利用凝胶层析将组分1进行脱盐,其峰2的IC50值达到0.0836mg/mL,脱盐率达到86.60%+0.5%。猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析、离子交换层析分离后,为了进一步纯化猪股骨降血压肽,采用制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)对离子交换层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱条件的优化,确定了最佳分离条件：0-5min 0-80%A;5-8min 80-100%A;8-15min 80-60%A;15-20min 60-20%A。结果显示：第一步RP-HPLC分离得到三个组分,其中峰Z2的活性最高,其IC50值为0.0437mg/mL;再将组分Z2进行第二步RP-HPLC分离,其峰Z21(记为组分H)的IC50值达到0.0352ms/ml,经纯度鉴定后,组分H的纯度为96.7%。通过分析组分H的氨基酸组成以及LC-MS的分离鉴定,其含有6种氨基酸(Glu,Ala,Val,Leu,PHe,Pro),其分子量为764.8D。
【关键词】：猪股骨酶解液 降血压肽 凝胶层析 离子交换层析 半抑制浓度
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ464.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-23
• 1.1 骨资源概况11-12
• 1.1.1 畜禽骨的营养价值11
• 1.1.2 骨资源利用11-12
• 1.2 降血压肽与高血压12-14
• 1.2.1 高血压概况12
• 1.2.2 高血压的危害及治疗12
• 1.2.3 血管紧张素转换酶的概述12-13
• 1.2.4 ACE与高血压的关系13
• 1.2.5 降血压肽的概况13
• 1.2.6 降血压肽优势13-14
• 1.3 降血压肽分离背景14
• 1.4 国内外降血压肽的分离纯化研究现状14-20
• 1.4.1 超滤(UF)分离14-15
• 1.4.2 大孔吸附树脂15
• 1.4.3 凝胶层析(GPC)15-16
• 1.4.4 离子交换层析(IEC)16-17
• 1.4.5 反相高效液相色谱(RP-HPLC)17-18
• 1.4.6 电泳法18
• 1.4.7 降血压活性肽序列研究18-19
• 1.4.8 降血压肽结构与功能的关系19-20
• 1.5 降血压肽活性检测方法研究现状20-21
• 1.5.1 体外检测20-21
• 1.5.2 体内检测21
• 1.6 本研究的目的与意义21-22
• 1.7 试验研究目标与内容22-23
• 2 材料与方法23-33
• 2.1 实验试剂与材料23
• 2.2 仪器设备23
• 2.3 方法23-24
• 2.3.1 猪股骨的前处理23-24
• 2.3.2 猪股骨降血压肽的制备24
• 2.3.3 酶解制备猪股骨降血压肽的工艺条件24
• 2.4 降血压肽的分离纯化24-30
• 2.4.1 超滤分级24-25
• 2.4.2 凝胶层析分离纯化25-26
• 2.4.3 离子交换层析26-27
• 2.4.4 脱盐27-28
• 2.4.5 制备型反相高效液相色谱分离纯化28-29
• 2.4.6 LC-MS鉴定29-30
• 2.5 指标的测定30-33
• 2.5.1 ACE抑制率的测定30-31
• 2.5.2 IC_(50)值测定方法31
• 2.5.3 蛋白质含量测定31-32
• 2.5.4 酶活力测定32-33
• 2.5.5 色值测定33
• 2.5.6 澄清度测定33
• 2.5.7 蛋白质浓度的测定33
• 2.5.8 数据统计分析33
• 3 结果与分析33-47
• 3.1 猪股骨蛋白质含量33
• 3.2 蛋白酶活力测定33
• 3.3 微孔滤膜过滤的影响33-34
• 3.4 超滤34
• 3.5 凝胶层析法对分离效果的影响34-38
• 3.5.1 不同洗脱液对分离效果的影响34-35
• 3.5.2 不同流速对分离效果的影响35-37
• 3.5.3 不同上样量对分离效果的影响37-38
• 3.5.4 确定洗脱条件38
• 3.6 离子交换层析分离38-42
• 3.6.1 不同pH洗脱液对分离效果的影响39-40
• 3.6.2 不同离子强度对分离效果的影响40-41
• 3.6.3 不同洗脱流速对分离效果的影响41-42
• 3.6.4 确定最佳分离条件42
• 3.7 脱盐42-43
• 3.8 制备型RP-HPLC分离降血压肽43-46
• 3.8.1 两步反相高效液相分离43-45
• 3.8.2 纯度鉴定45
• 3.8.3 氨基酸成分分析45-46
• 3.9 LC-MS鉴定46-47
• 4 讨论与结论47-49
• 4.1 讨论47-48
• 4.1.1 关于超滤47
• 4.1.2 关于凝胶层析47
• 4.1.3 关于离子交换层析47-48
• 4.1.4 关于制备型反相高效液相色谱48
• 4.2 结论48-49
• 5 问题与展望49-50
• 参考文献50-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士期间发表文章59

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9 杨U，

本文编号：268162