表位加工控制鸡蛋卵类粘蛋白致敏性的研究

发布时间：2020-11-11 05:19

　　 目的:通过食品级加工技术获得低致敏卵类粘蛋白产物,探索其表位与致敏性变化的关系,为低致敏或脱敏鸡蛋产品的研发提供理论指导。方法:1.卵类粘蛋白的分离纯化:新鲜鸡蛋去壳并分离鸡蛋黄后,先通过预处理除去卵粘蛋白等干扰蛋白,再应用CM-Sepharose FF阳离子交换层析法,使卵类粘蛋白先于卵白蛋白洗脱出来,消除卵白蛋白含量大、出峰时间长对卵类粘蛋白纯化的影响,从而获得高纯度卵类粘蛋白。通过电泳和质谱分析进行鉴定,通过灰度分析蛋白纯度。收集纯度大于90%的卵类粘蛋白。2.卵类粘蛋白的去折叠与烷基化处理:采用谷胱甘肽还原法和半胱氨酸还原法破坏分子内二硫键。根据电泳图谱中各目标条带的泳动率,检测不同还原条件下的去折叠效率及兔血清IgG结合能力,结合与过敏患者血清IgE结合能力确定最优还原条件,制备去折叠卵类粘蛋白用于后续实验。在还原法破坏卵类粘蛋白的二硫键后,由于还原条件的改变或还原剂量降低易导致二硫键重新折叠,因此,在检测前先通过烷基化反应屏蔽巯基,并利用离心浓缩除去过量反应物使结果更精确。3.美拉德反应影响卵类粘蛋白致敏性条件的优化:加热温度、加热时间、还原糖种类、还原方法的不同以及还原糖的比例等是美拉德反应重要的影响因素。先通过单因素实验确定影响卵类粘蛋白致敏性的因素,然后根据结果来判断是否需要继续通过响应面法进行优化,将反应条件最优的卵类粘蛋白产物用于下一步研究。4.糖化卵类粘蛋白免疫反应性的评估:将去折叠前后的卵类粘蛋白糖化并诱导其重新折叠,通过间接EILSA或竞争抑制ELISA检测去折叠前后卵类粘蛋白的兔血清IgG结合能力和鸡蛋过敏患者血清IgE结合能力,选择结合能力最低的糖化产物,通过圆二色谱、紫外光谱和荧光光谱分别分析其二级和三级结构特征,通过与烷基化卵类粘蛋白比对,确定卵类粘蛋白重新折叠发生;通过与未处理卵类粘蛋白比对,确定二硫键是否在原来的位置重新形成。5.动物实验评估卵类粘蛋白产物致敏性:用低IgE结合卵类粘蛋白产物免疫小鼠,通过观察小鼠过敏症状、检测致敏小鼠血清中IgE,IgG,IgG1,IgG2a的水平、检测脾细胞IL-4,IL-10,IL-13等细胞因子水平的变化等完成动物实验评估。结果:1.卵类粘蛋白的分离纯化:经过一个完整的分离过程(2 h),可以收集到14.33mg卵类粘蛋白,得率为45.8%,纯度为94.1%,显示出与卵类粘蛋白标准品相似的免疫活性。2.最佳还原条件:选择谷胱甘肽作为还原剂,还原剂浓度为1 mg/ml时,产物与小鼠血清IgG及人血清IgE结合能力下降最显著。3.去折叠卵类粘蛋白结构变化:二级结构发生改变,主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,荧光光谱结果显示疏水性改变。4.最佳糖化条件:麦芽糖与卵类粘蛋白赖氨酸残基比例为10:1,加热温度为90℃,加热时间为8 h时,与兔血清IgG结合能力结果显示该糖化条件加工后的卵类粘蛋白(G-M-OVM)的IC_(50)值由0.3741μg/ml上升到112.6μg/ml,与过敏患者血清IgE结合能力检测结果显示G-M-OVM相比于未加工的卵类粘蛋白(OVM)IgE结合能力显著下降(P0.05)。5.卵类粘蛋白的重新折叠:诱导重新折叠的卵类粘蛋白未完全在原来的位置发生折叠。6.动物实验评估:小鼠血清特异性抗体IgE、IgG、IgG1和IgG2a水平相比于未加工的卵类粘蛋白组小鼠均下降(P0.05)。与未加工的卵类粘蛋白比较,加工后的卵类粘蛋白刺激脾脏产生的IL-4,IL-17A和IFN-γ的水平均下降(P0.05)。结论:1.本研究开发了一种简单方便的色谱方法,可以在2小时内分离出高纯度的卵类粘蛋白,与商业卵类粘蛋白标准品具有相似的免疫活性,可以用于实验室研究。2.通过去折叠-糖化-重新折叠获得低致敏卵类粘蛋白产物。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：TS253.1
【部分图文】：

技术路线Fig1.Technicalroute

遵义医科大学硕士学位论文梁汭·17(7)终止反应：每孔加入50μl2mol/LH2SO4终止反应。(8)比色：用酶标仪在490nm处测吸光值。1.4结果1.4.1CM-SepharoseFF阳离子交换层析法纯化蛋清中的卵类粘蛋白根据卵类粘蛋白的等电点和CM-SepharoseFF的使用说明，将蛋清上样溶液的pH调至3.8。预先用醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.7）平衡层析介质,在蛋清上样后用相同的缓冲液洗脱。当层析柱的pH从3.8增加到4.7后，在上样后60、230和260min分别洗脱出三个峰，洗脱曲线如图1.1所示。结合三个分离峰的SDS-PAGE（图1.2）结果发现，第一个峰(F1)中洗脱出蛋白质为卵类粘蛋白；卵白蛋白在第二和第三个峰(F2和F3)中洗脱出来(图1.2a)。从图2.2a的F1泳道可以发现卵类粘蛋白显示出弥散条带，该结果与Bloom的结果相同[54]，原因可能是由于卵类粘蛋白的高糖基化率。将分离的卵类粘蛋白冻干后，取90μg上样，结果仍未显示杂质(图1.2b)，通过灰度分析显示本实验分离的卵类粘蛋白的纯度达到94.09%。F2以卵白蛋白为主，纯度为79.03%。通过图1.1发现，在120min时，卵类粘蛋白已经完全洗脱出来，卵白蛋白的纯化延长了分离过程。通过以上结果可以发现，CM-SepharoseFF可以在上样2h内获得卵类粘蛋白纯品。图1.1CM-SepharoseFF分离蛋清组分（F）阳离子层析曲线

遵义医科大学硕士学位论文梁汭·18Fig1.1Elutionpatternoftheeggwhitefractions(F)obtainedbyCM-Sepharosefastflowcation-exchangechromatography图1.2(a)通过离子交换层析获得的分离峰和(b)较高浓度(90μg)的纯化卵类粘蛋白的SDS-PAGEFig1.2SDS-PAGEof(a)fractionsobtainedbyion-exchangechromatographyand(b)purifiedovomucoidloadedatahigherconcentration1.4.2卵类粘蛋白的得率经凯氏定氮法测得全蛋清中蛋白质含量为11.38％。经过一个完整的分离纯化过程，收集到14.33mg卵类粘蛋白，得率为45.8％。表1.1与报道方法相比本方案纯化卵类粘蛋白的得率与纯度Table1.1Yieldandpurityofovomucoidpurifiedinthisprotocolcomparedwithreportedmethod方法纯度(%)得率(%)CM-SepharoseFF阳离子交换层析柱(本方案)94.145.8Q-SepharoseFF联合CM-Toyopearl650M阳离子交换色谱法[55]90.021.0乙醇沉淀加酸性硫酸铵沉淀卵类粘蛋白[56]91.4100.0不同浓度的乙醇沉淀卵类粘蛋白[56]92.3100.0三氯乙酸加硫酸铵两步纯化卵类粘蛋白[57]99.227.1双水相系统[58]ND90.0ND：NotDetected
【参考文献】

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2 王帅;吴子健;刘建福;胡志和;王连芬;;鸡卵类黏蛋白结构与性质研究进展[J];食品科学;2014年17期

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本文编号：2878800