微囊藻毒素降解酶MlrA的酶学特性表征及其结构功能解析

发布时间：2021-04-19 19:12

　　水体富营养化加剧致使蓝藻水华频繁暴发,产生的次生代谢产物——微囊藻毒素（microcystins,MCs）对水生态系统与公众健康构成严重威胁。微生物作为生物群落中的分解者,在MCs的自然降解中具有重要驱动作用。通过DNA文库筛选与基因异源表达,在MCs降解菌中鉴定出编码功能水解酶的mlr基因簇（mlrABCD）。其中,MlrA（亦称microcystinase）负责催化起始反应,将环状MCs水解为低毒性线性产物。前期研究从滇池底泥筛选获得1株Sphingopyxis sp.USTB-05菌,该菌能遵循mlr机制对多种MCs进行降解。然而,野生菌生理系统中酶系较为复杂,缺少对MlrA酶学性质、活化机理、结构特征与底物水解机制的相关认识,严重制约了相应菌体或酶制剂在水体修复中的应用。因此,针对以上问题,本研究采用基因工程技术将USTB-05菌的mlrA基因克隆至大肠杆菌,重组表达MlrA后研究了其酶学性质;然后,在分析了该酶同源性、序列性质及系统发育关系的基础上,利用计算结构生物学模拟了MlrA的三维分子结构;最后,将MlrA与MC-LR进行分子对接,提出了该酶的底物水解机理,并通过定点突... 

【文章来源】：江西理工大学江西省

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 研究背景
    1.2 微囊藻毒素概述
        1.2.1 种类与结构
        1.2.2 生物合成机理与装配过程
        1.2.3 环境风险与毒理作用
    1.3 微囊藻毒素微生物降解研究现状
        1.3.1 细菌
        1.3.2 真菌
        1.3.3 水生植物
        1.3.4 原生动物
    1.4 细菌降解微囊藻毒素的功能基因与酶促途径
        1.4.1 降解基因
        1.4.2 酶促途径
    1.5 细菌微囊藻毒素降解酶MlrA的结构生物学研究
        1.5.1 结构特征
        1.5.2 功能特性
        1.5.3 活性位点
    1.6 研究目标、内容、意义及技术路线图
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究目标
        1.6.3 研究意义
        1.6.4 技术路线图
第二章 微囊藻毒素降解酶MlrA的原核表达及酶学性质表征
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 培养基
        2.1.3 主要化学试剂
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 实验仪器与设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 目的基因获取
        2.2.2 原核表达载体的构建
        2.2.3 重组菌的构建及鉴定
        2.2.4 重组MlrA酶的表达与提取
        2.2.5 SDS-PAGE分析
        2.2.6 酶活性检测
        2.2.7 液相色谱分析
        2.2.8 MC-RR的定量测定
        2.2.9 重组MlrA酶学性质分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 质粒构建
        2.3.2 重组酶的诱导表达
        2.3.3 酶催化活性检测
        2.3.4 重组USTB-05-Mlr A的最适反应温度及热稳定性
        2.3.5 重组USTB-05-Mlr A的最适反应p H及 p H稳定性
        2.3.6 金属离子和化学试剂对重组USTB-05-Mlr A催化活性的影响
    2.4 本章小结
第三章 微囊藻毒素降解酶MlrA的计算结构生物学研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 蛋白质信息数据库
        3.1.2 生物信息分析软件及工具
        3.1.3 实验仪器与设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 序列检索
        3.2.2 氨基酸与结构域分析
        3.2.3 系统发育分析
        3.2.4 酶分子模型的构建与优化
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 同源性分析
        3.3.2 序列比对及功能基因挖掘
        3.3.3 MlrA类似物的鉴定
        3.3.4 氨基酸理化特性
        3.3.5 MlrA的进化关系
        3.3.6 分子结构模拟
    3.4 本章小结
第四章 微囊藻毒素降解酶MlrA的底物水解机理
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株与质粒
        4.1.2 培养基
        4.1.3 主要化学试剂
        4.1.4 主要溶液
        4.1.5 实验仪器与设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 模型分析
        4.2.2 活性位点分析
        4.2.3 分子对接
        4.2.4 定点突变
        4.2.5 MlrA点突变体的重组表达与提取
        4.2.6 MlrA点突变体的酶活分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 MlrA的结构特征
        4.3.2 酶活性位点预测
        4.3.3 MlrA与 MC-LR的结合方式
        4.3.4 MlrA的底物水解机理
        4.3.5 MlrA点突变体的催化活性
        4.3.6 EDTA与MlrA的作用模式
    4.4 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 主要结论
    5.2 主要创新点
    5.3 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同工艺给水厂对典型微囊藻毒素的去除研究[J]. 姜蕾.  给水排水. 2017(09)
[2]一株降解微囊藻毒素的缺陷短波单胞菌的分离鉴定及降解特性研究[J]. 谷青,赵琪,史全良.  环境科学学报. 2017(01)
[3]蓝藻水华及其次生危害[J]. 谢平.  水生态学杂志. 2015(04)
[4]蓝藻毒素去除方法研究进展[J]. 江敏,王婧,许慧.  生态学杂志. 2014(12)
[5]压力强化混凝除藻工艺中藻毒素安全性研究[J]. 蒋新跃,栾清,丛海兵,徐思涛,刘玉娇,朱学源.  环境科学. 2014(11)
[6]微囊藻毒素微生物降解途径与分子机制研究进展[J]. 闫海,王华生,刘晓璐,尹春华,许倩倩,吕乐,马万彪.  环境科学. 2014(03)
[7]富营养化湖泊中微囊藻毒素及其控制去除技术[J]. 苏雅玲,邓一荣.  环境科学与技术. 2013(06)
[8]Cloning and expression of the first gene for biodegrading microcystin LR by Sphingopyxis sp.USTB-05[J]. Hai Yan 1,,Huasheng Wang 1,2,Junfeng Wang 1,Chunhua Yin 1,Song Ma 1,Xiaolu Liu 1,Xueyao Yin 1 1.School of Chemical and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China.2.School of Architectural and Surveying & Mapping Engineering,Jiangxi University of Science and Technology,Ganzhou 341000,China.  Journal of Environmental Sciences. 2012(10)
[9]白腐菌S.commune降解微囊藻毒素-LR的研究[J]. 张韫,谢慧芳.  环境污染与防治. 2012(10)
[10]一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究[J]. 吴涓,钟升,王光云,李玉成.  中国环境科学. 2011(01)

博士论文
[1]谷胱甘肽过氧化物酶突变体及其模拟物的表达与表征[D]. 郭笑.吉林大学 2015



本文编号：3148141