琼胶酶高产菌株的选育和红藻寡糖的酶法制备与分析

发布时间：2017-04-18 21:21

  本文关键词：琼胶酶高产菌株的选育和红藻寡糖的酶法制备与分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：紫菜、龙须菜等红藻养殖业在我国沿海一带发展迅速,产量增长迅速。多糖是红藻中含量最多的成分之一。红藻多糖具有较好的生物活性和重要的开发价值,但由于其分子量大,粘度高,难以进入机体细胞发挥作用,其开发应用受到了限制。因此,降低红藻多糖的分子量和粘度成为了开发利用红藻多糖的关键。琼胶酶的开发对于红藻的高值化利用意义深远。本论文从产酶菌株的筛选、鉴定、发酵条件优化、酶的分离纯化、酶学性质、红藻多糖的提取和降解、酶解产物的结构与活性关系等方面进行了系统研究。1.通过平板初筛和摇瓶复筛从青岛近海的红藻样品中筛选出了一株高产琼胶酶菌株,并对其进行了形态学和分子生物学鉴定,结构显示该菌株属于假交替单胞菌,命名为Pseudoalteromonas sp. QJ97。通过单因素试验和响应面试验相结合的手段确立了Pseudoalteromonas sp. QJ97最佳发酵条件为琼脂3.96g/L、乳糖4.0 g/L、NH4NO3 2.0 g/L、K2HPO4 1.5 g/L, NaCl 11.27 g/L,温度31℃接种量2%、装液量30 mL、pH 8.0、转速160 r/min。在最佳条件下发酵24 h,发酵液的酶活力为625.93 U/mL,是优化前的2.02倍。通过测定Pseudoalteromonas sp.QJ97的生长曲线和产酶曲线可知在发酵过程中该菌株在28 h达到生物量的最高值,在32 h达到产酶量最高值。2.通过丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等方法对菌株QJ97的发酵液进行了分离纯化,得到了电泳纯度的琼胶酶。该琼胶酶的纯化倍数为11.18,比活力为23922.00 U/mg。电泳结果表明酶的相对分子质量约为35 kDa,该分子量不同于以往的报道。然后对纯化后的琼胶酶的酶学性质进行了研究,结果表明：琼胶酶的最适反应温度和pH分别为40℃,6.0。该琼胶酶对NaCl有很强的耐受性。Ca2+, Mg2*, Ba2+和K+对酶活力影响很小,Zn2+, Cu2+, Mn2+和Fe3+的存在都会抑制琼胶酶的活性。低浓度的Co2+对琼胶酶几乎无影响,但高浓度的Co2+会强烈抑制琼胶酶的活性。低浓度的SDS可使琼胶酶完全失活。琼胶酶对EDTA相对稳定。琼胶酶的Km和Vmax分别为5.361g/L,0.244 g/L/min。该琼胶酶具有较强的底物专一性,可高效降解琼胶,对褐藻酸钠、卡拉胶、壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶和可溶性淀粉均无降解作用。3.通过单因素试验确定了紫菜多糖(PHP)、龙须菜多糖(GLP)和石花菜多糖(GAP)进行热水提取的最佳料液比分别为1：40,1：30,1：30,浸提时间为4 h。通过对红藻多糖酶解条件的研究,确立了红藻多糖酶解的最佳工艺条件为：酶添加量4%,酶解温度40℃,体系pH 6.0,酶解时间2 h。对乙醇沉淀的工艺进行了优化,结果表明三种酶解液的最佳浓缩倍数分别为4,5,5,最佳pH为8,乙醇倍数应选择4为宜。4.通过高效液相色谱(HPLC)技术对三种红藻多糖的单糖组成进行了分析,结果显示PHP、GLP和GAP均以半乳糖作为主要成分,含量分别为93.0%,78.7%,79.3%。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)技术对酶解产物各分级组分的成分进行了分析,并结合抗氧化实验和抑菌实验结果对红藻多糖酶解产物的活性和结构的关系进行了探讨。结果表明红藻多糖及其酶解产物的.OH清除能力与样品浓度均呈现明显的量效关系。通过纵向对比同一红藻多糖的酶解产物各分级组分的结构和活性的大小关系,以及横向对比三红藻多糖酶解产物中活性最大的组分的结构和活性的大小关系,明确了样品.OH清除能力的影响因素。整体而言,聚合度大小和硫酸基含量降低,.OH清除能力呈下降趋势。聚合度8-16的偶数糖可能有较强的羟自由基清除能力。除此以外,红藻寡糖的单糖组成也可能影响红藻寡糖的.OH清除能力。红藻多糖对所有供试菌株无抑制作用,但经过降解后获得的部分寡糖样品对四联球菌表现出了较明显的抑菌效果。通过测定各组分的MIC值并进行了结构和抑菌活性的对比,结果表明聚合度大小和硫酸基含量对抑菌活性存在影响,聚合度6-16的偶数糖可能具有较好的抑菌效果,聚合度大小较硫酸基含量对抑菌活性的影响更大。
【关键词】：琼胶酶 假交替单胞菌 分离纯化 酶学性质 结构 活性
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS254.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-31
• 0.1 琼胶酶的研究现状及研究意义14-20
• 0.1.1 琼胶酶的主要来源14-15
• 0.1.2 菌株产酶能力的测定15-16
• 0.1.3 天然琼胶酶的特征16-18
• 0.1.4 琼胶酶的理论研究进展18
• 0.1.5 琼胶酶理论研究的现实意义18-20
• 0.2 红藻多糖及降解产物的研究进展20-24
• 0.2.1 红藻多糖的结构与活性20-22
• 0.2.2 红藻多糖的降解22-23
• 0.2.3 红藻寡糖的构效关系研究23-24
• 0.3 立题依据及研究内容24-26
• 0.3.1 立题依据和意义24-25
• 0.3.2 研究内容25-26
• 参考文献26-31
• 1 高产琼胶酶菌株的筛选、鉴定及发酵条件优化31-56
• 1.1 引言31
• 1.2 材料与仪器31-32
• 1.2.1 试剂31-32
• 1.2.2 主要仪器32
• 1.2.3 培养基32
• 1.3 方法32-37
• 1.3.1 样品采集32-33
• 1.3.2 平板初筛33
• 1.3.3 复筛33
• 1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制33-34
• 1.3.5 琼胶酶活力的测定方法34
• 1.3.6 菌株的形态学鉴定34
• 1.3.7 分子生物学鉴定34-35
• 1.3.8 传代数对菌株产酶稳定性的影响35
• 1.3.9 单因素优化35-37
• 1.3.10 响应面试验优化发酵条件37
• 1.3.11 菌株QJ97的生长曲线和产酶曲线的测定37
• 1.4 结果与分析37-53
• 1.4.1 高产琼胶酶菌株的筛选37-38
• 1.4.2 菌株QJ97的形态学特征38-39
• 1.4.3 菌株QJ97 16S rDNA的测序结果和系统进化树39-40
• 1.4.4 产酶稳定性结果40-41
• 1.4.5 培养基组成优化41-46
• 1.4.6 培养条件优化46-48
• 1.4.7 响应面优化48-52
• 1.4.8 菌株QJ97的生长曲线及产酶曲线52-53
• 1.5 本章小结53-54
• 参考文献54-56
• 2 琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究56-72
• 2.1 引言56
• 2.2 材料与仪器56-57
• 2.2.1 材料56-57
• 2.2.2 仪器57
• 2.3 方法57-60
• 2.3.1 酶活力的测定57
• 2.3.2 蛋白含量的测定57-58
• 2.3.3 粗酶液的制备58
• 2.3.4 琼胶酶的分离纯化58-59
• 2.3.5 SDS-PAGE测定琼胶酶的分子量59
• 2.3.6 酶学性质研究59-60
• 2.4 结果与分析60-69
• 2.4.1 丙酮沉淀结果60-61
• 2.4.2 Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析61-62
• 2.4.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析62
• 2.4.4 Pseudoalteromonas sp.QJ97所产琼胶酶的纯化结果62-63
• 2.4.5 SDS-PAGE电泳63-64
• 2.4.6 酶学性质研究64-69
• 2.5 本章小结69-70
• 参考文献70-72
• 3 红藻多糖的提取及其酶降解工艺研究72-84
• 3.1 引言72
• 3.2 材料与仪器72-73
• 3.2.1 材料72-73
• 3.2.2 仪器73
• 3.3 方法73-76
• 3.3.1 还原糖的质量浓度73
• 3.3.2 总糖的质量浓度73-74
• 3.3.3 多糖得率的计算74
• 3.3.4 还原糖得率的计算74
• 3.3.5 红藻多糖的热水提取74
• 3.3.6 红藻多糖的制备74-75
• 3.3.7 红藻多糖的酶法降解75
• 3.3.8 红藻多糖的酶解及乙醇分级沉淀75-76
• 3.4 结果与分析76-82
• 3.4.1 红藻多糖的热水提取76-77
• 3.4.2 红藻多糖的酶法降解77-80
• 3.4.3 乙醇沉淀工艺优化80-82
• 3.5 本章小结82-83
• 参考文献83-84
• 4 红藻寡糖结构和活性的关系研究84-103
• 4.1 引言84
• 4.2 材料与仪器84-85
• 4.2.1 材料84-85
• 4.2.2 仪器85
• 4.3 方法85-89
• 4.3.1 红藻多糖的酶降解及产物的分级沉淀85-88
• 4.3.2 酶解产物的结构分析88
• 4.3.3 红藻多糖及其酶解产物羟自由基(·OH)清除能力测定88-89
• 4.3.4 红藻多糖及其酶解产物抑菌活性的测定89
• 4.4 结果与分析89-100
• 4.4.1 红藻多糖的HPLC分析89-91
• 4.4.2 酶解产物的ESI-MS分析91-96
• 4.4.3 红藻多糖及其酶解产物的·OH清除能力与结构的关系96-98
• 4.4.4 红藻多糖及其酶解产物的抑菌活性与结构的关系98-100
• 4.5 本章小结100-101
• 参考文献101-103
• 结语与展望103-104
• 论文创新点104-105
• 致谢105-106
• 个人简历106
• 在学期间发表的学术论文与研究成果106

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