泡萝卜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克

发布时间：2022-07-04 19:55

　　本文利用实验室前期从萝卜泡菜中筛选出一株具有降解亚硝酸盐能力的植物乳杆菌为研究材料,根据GenBank中亚硝酸盐还原酶（nir）基因序列,利用生物信息学软件设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增亚硝酸盐还原酶（nir）基因,TA克隆获得重组质粒pMD19-nir,分析亚硝酸盐还原酶核苷酸序列的同源性。通过双酶切连接到表达载体pET-32a（+）中,获得重组表达质粒pET-32a（+）-nir,然后转化至E.coli BL（DE3）。由于目的蛋白形成了包涵体,对其进行纯化,然后进行酶学性质的初步分析,主要结论如下：（1）根据GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全部基因序列,设计特异性引物。采用PCR技术扩增亚硝酸盐还原酶（nir）基因,通过TA克隆获得重组质粒pMD19-nir。对重组质粒进行测序,然后用软件分析测序结果：亚硝酸盐还原酶（nir）基因开放阅读框（ORF）碱基的长度为1638bp,序列经NCBI Blast比对,与其它nir（JX434610-1）的最高同源性为99%。即成功克隆出亚硝酸盐还原酶的基因。（2）双酶切T克隆质... 

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩写词说明
1 前言
    1.1 文献综述
        1.1.1 四川泡菜概述
        1.1.2 亚硝酸盐的来源
        1.1.3 亚硝酸盐的危害
        1.1.4 硝酸盐降解方法的研究
        1.1.5 硝酸盐还原酶的研究进展
    1.2 研究目的和意义
    1.3 研究内容与技术路线
        1.3.1 实验的研究内容
        1.3.2 实验技术路线
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 供试菌种及克隆载体
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 试剂和培养基的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 亚硝酸盐还原酶基因的克隆
        2.2.2 亚硝酸盐还原酶基因的原核表达
        2.2.3 重组酶的纯化
        2.2.4 重组酶的酶学性质研究
3 结果与分析
    3.1 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的克隆
        3.1.1 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的扩增
        3.1.2 T克隆的PCR鉴定
        3.1.3 T克隆的双酶切鉴定及序列比对结果
    3.2 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的表达
        3.2.1 重组质粒pET-32a(+)-nir的PCR鉴定
        3.2.2 重组质粒pET-32a-nir的双酶切鉴定
        3.2.3 亚硝酸盐还原酶在大肠杆菌中的表达
    3.3 重组酶的纯化
        3.3.1 重组酶纯化后的电泳检测
    3.4 重组酶的酶学性质分析结果
        3.4.1 亚硝酸钠的标准曲线
        3.4.2 不同温度对重组酶酶活的影响
        3.4.3 不同pH值对重组酶酶活的影响
        3.4.4 Km值的测定
4 讨论
    4.1 亚硝酸盐还原酶基因的克隆和表达
    4.2 包涵体的纯化
    4.3 酶学性质的分析
    4.4 酶活力的分析
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的学术论文
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]大蒜对蔬菜亚硝酸盐消除作用的实验研究[J]. 詹秀环,付星锋,王子云.  中国调味品. 2015(01)
[2]四川泡菜质量安全与风险防控[J]. 王玲,王利娟,程金权.  食品与发酵科技. 2014(06)
[3]几种茶叶冲泡液对亚硝化反应抑制作用比较[J]. 钟希琼,梁少珊,蔡绮纯,张英慧.  食品科技. 2014(03)
[4]泡菜发酵过程中亚硝酸盐生成及降解机理研究[J]. 马延岩.  食品科技. 2013(10)
[5]2株乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用及其降解机理的初步分析[J]. 林浩,林伟锋,陈中.  食品与发酵工业. 2013(07)
[6]木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达[J]. 张雪,陈萍,毕云枫,曲宁宁,刘琼,孙鑫泽.  吉林大学学报(医学版). 2013(04)
[7]乳酸菌降解亚硝酸盐的发酵条件研究[J]. 顾诗雯,何婷婷,丁少南,龚钢明.  食品研究与开发. 2013(12)
[8]四川泡菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选鉴定及其应用[J]. 杜晓华,刘书亮,蒲彪,陈功,颜正财.  食品与发酵工业. 2013(04)
[9]四川泡菜乳酸菌多样性及其功能特性[J]. 陈功,张其圣,余文华,宋萍,刘竹,李恒,游敬刚.  食品与发酵工业. 2013(03)
[10]腌制水产品中N-亚硝胺物质的危害分析及预防控制[J]. 王秀元,蔣玲波,王萍亚,赵华.  安徽农业科学. 2013(03)

硕士论文
[1]干酪乳杆菌LCR 6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原酶的表征[D]. 张馨月.华南理工大学 2014
[2]腌制食品中亚硝酸盐生物降解的研究[D]. 苏肖晶.吉林农业大学 2014
[3]快速降解亚硝酸盐的菌种选育及亚硝酸盐还原酶的分离纯化研究[D]. 相苒.吉林农业大学 2013
[4]发酵萝卜中亚硝酸盐的变化规律及相关微生物的分离和发酵特性研究[D]. 郭双霜.四川农业大学 2013
[5]植物乳杆菌中亚硝酸还原酶的研究[D]. 丁少南.上海师范大学 2013
[6]乳酸菌制剂发酵泡菜工艺及安全性研究[D]. 李文婷.西华大学 2012
[7]植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因的研究[D]. 何婷婷.上海师范大学 2012
[8]产亚硝酸盐还原酶短乳杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化研究[D]. 吕玉涛.上海师范大学 2010
[9]发酵蔬菜中亚硝酸盐的生成及降解机理研究[D]. 马延岩.天津科技大学 2010
[10]产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用[D]. 郑怀忠.集美大学 2009



本文编号：3655822