α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制

发布时间：2017-07-20 02:12

  本文关键词：α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制

  更多相关文章： 谷氨酸棒状杆菌 α-酮戊二酸 L-谷氨酸 糖酸转化率 敲除 生物素

【摘要】：α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)是微生物体内的三羧酸循环的重要中间产物,它作为碳氮代谢的关键节点,在菌体的生长代谢中发挥重要作用。在医药、食品、化妆品、工农业及化工合成等领域中,a-KG被广泛使用。a-KG的主要制备方法为化学法和微生物发酵法。发酵法研究的较多的是真核微生物,而对于利用原核微生物中谷氨酸棒状杆菌制备a-KG的方法,国内外的相关报道较少。本论文以敲除谷氨酸脱氢酶I编码基因gdh的谷氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum GDK-9△gdh为出发菌株,通过分子改造和发酵过程控制两方面研究该菌株积累a-KG的情况。主要研究结果如下：以GDK-9△gdh为出发菌株,敲除谷氨酸脱氢酶II的编码基因gdhA,成功构建菌株GDK-9△gdh△gdhA。在摇瓶及发酵罐的发酵实验中,相比出发菌株,菌株GDK-9△gdh△gdhA的a-KG的积累量分别提高了10.99%和7.49%,副产物L-谷氨酸含量降低了5.72%和15.78%,糖酸转化率提高了7.13%和7.36%；实验结果表明敲除基因gdhA有助于增加α-KG积累,对副产物积累量的降低也有积极意义。谷丙转氨酶可以催化丙氨酸与a-KG生成L-谷氨酸,从而降低目的产物a-KG的含量,同时增加副产物L-谷氨酸的积累。从菌株GDK-9△gdh出发,敲除谷丙转氨酶的编码基因,构建基因缺失菌株GDK-9△gdh△alaT,经摇瓶及发酵罐发酵实验结果显示,在alaT缺失菌株的副产物积累量降低的同时,目的产物a-KG的合成量并未增加,同时菌体的生长相比出发菌株较弱,说明谷丙转氨酶对菌体的生长有重要作用,在敲除谷氨酸脱氢酶I的条件下,谷丙转氨酶不是合成L-谷氨酸的主要反应。谷氨酸合酶催化a-KG和谷氨酰胺生成谷氨酸是副产物生成的又一途径,以GDK-9△gdh△gdhA为出发菌株,敲除谷氨酸合酶的编码基因gogat,成功构建菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat,在摇瓶发酵及发酵罐发酵实验中,改造菌株的副产物L-谷氨酸积累量降低,同时菌体的生长与产酸也变弱,说明谷氨酸合酶可能与调控菌体的生长因素有关,改造菌株的产酸延滞表明该基因可能与谷氨酸大量合成有密切联系。在GDK-9△gdh的基础上,敲除异柠檬酸裂解酶的编码基因aceA,成功构建菌株GDK-9△gdh△aceA,在摇瓶及发酵罐的发酵实验中,改造菌株的a-KG合成量分别提高了17.57%和4.07%,糖酸转化率分别提高了14.39%和9.09%。说明敲除异柠檬酸裂解酶后,增加了合成目的产物的主碳代谢流通量,有助于积累a-KG。为进一步提高菌体积累a-KG的能力,以GDK-9△gdh△aceA为出发菌株,过表达编码柠檬酸合酶的基因prpc,构建了过表达菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空质粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19,通过发酵实验结果显示,在摇瓶发酵和发酵罐发酵过程中,prpc过表达菌株和空质粒菌株相比,a-KG的合成量分别提高了10.19%和3.69%,糖酸转化率分别提高了7.68%和6.51%。选择GDK-9△gdh△gdhA为供试菌株,研究了双阶段pH和生物素控制策略下菌体的产酸情况,结果表明,双阶段pH控制法相比较于单阶段pH控制法所获得的L-谷氨酸减少了80.11%,α-KG积累增加了67.31%,糖酸转化率提高了55.86%。在双阶段pH控制条件下,研究确定了发酵初始培养基中的最适生物素浓度为7μg/L,在发酵后期16 h-26 h时期内添加生物素的最适浓度为5μg/L。在最终的发酵结果中使用双阶段pH和生物素控制下的发酵过程糖酸转化率相比较双阶段pH控制提高了7.82%。
【关键词】：谷氨酸棒状杆菌 α-酮戊二酸 L-谷氨酸 糖酸转化率 敲除 生物素
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ921
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 前言11-24
• 1.1 α-酮戊二酸的理化性质11
• 1.2 α-酮戊二酸的应用11-12
• 1.3 α-酮戊二酸的生产概况12-14
• 1.3.1 α-酮戊二酸的生产方法12-13
• 1.3.2 发酵法生产α-酮戊二酸的历史13
• 1.3.3 α-酮戊二酸发酵生产菌株13-14
• 1.4 α-酮戊二酸的合成途径及代谢调控机制14-17
• 1.4.1 α-酮戊二酸的合成途径14-15
• 1.4.2 α-酮戊二酸合成的代谢调控机制15-17
• 1.5 α -酮戊二酸生产菌的生化特性及育种思路17-18
• 1.5.1 α-酮戊二酸生产菌具备的生化特征17
• 1.5.2 α-酮戊二酸生产菌的育种思路17-18
• 1.6 α-酮戊二酸的发酵优化策略18-21
• 1.6.1 α-酮戊二酸生产的培养基18-20
• 1.6.2 α-酮戊二酸发酵条件优化20-21
• 1.7 α-酮戊二酸的测定方法21-22
• 1.8 论文立题依据及主要研究内容22-24
• 1.8.1 立题依据22-23
• 1.8.2 主要研究内容23-24
• 2 材料与方法24-42
• 2.1 实验材料24-30
• 2.1.1 菌株与质粒24-25
• 2.1.2 主要仪器25-26
• 2.1.3 主要试剂26-28
• 2.1.4 主要溶液28-29
• 2.1.5 主要培养基29-30
• 2.2 实验方法30-39
• 2.2.1 质粒提取30
• 2.2.2 谷氨酸棒状杆菌基因组的提取30-31
• 2.2.3 PCR扩增31-34
• 2.2.4 DNA限制性内切酶酶切34
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳34
• 2.2.6 DNA的回收纯化34-35
• 2.2.7 连接与转化35-36
• 2.2.8 感受态细胞制备36-37
• 2.2.9 重组质粒的构建37
• 2.2.10 转化子鉴定37-38
• 2.2.11 目的基因测序38
• 2.2.12 重组质粒电转化及基因缺失菌株的筛选38-39
• 2.3 发酵培养方法39
• 2.3.1 斜面活化培养39
• 2.3.2 摇瓶与发酵罐的种子培养39
• 2.3.3 摇瓶补料分批发酵39
• 2.3.4 发酵罐补料分批发酵39
• 2.4 分析方法39-42
• 2.4.2 菌体干重的计算39-40
• 2.4.3 培养液pH的测定40
• 2.4.4 残糖的测定40
• 2.4.5 有机酸的测定40
• 2.4.6 氨基酸的测定40-41
• 2.4.7 数据分析41-42
• 3 结果与讨论42-63
• 3.1 菌株GDK-9△gdh△gdhA的构建及发酵实验42-47
• 3.1.1 重组片段△gdhA的构建42-43
• 3.1.2 重组质粒pK18mobsacB△gdhA的构建43-44
• 3.1.3 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA的构建44-45
• 3.1.4 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA和GDK-9△gdh的摇瓶发酵实验45-46
• 3.1.5 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA和GDK-9△gdh的5L发酵罐发酵实验46-47
• 3.1.6 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA的发酵结果讨论47
• 3.2 alaT基因敲除菌株GDK-9△gdh△alaT的构建及发酵实验47-50
• 3.2.1 重组片段△alaT的构建47-48
• 3.2.2 重组质粒pK18mobsacB△alaT的构建48
• 3.2.3 重组菌株GDK-9△gdh△alaT的构建48-49
• 3.2.4 重组菌株GDK-9△gdh△alaT的摇瓶发酵实验49
• 3.2.5 重组菌株GDK-9△gdh△alaT的5 L发酵罐发酵实验49
• 3.2.6 重组菌株GDK-9△gdh△alaT的发酵发酵结果讨论49-50
• 3.3 菌株GDK-9△gdhAgdhA△gogat的构建及发酵实验50-52
• 3.3.1 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的构建50-51
• 3.3.2 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的摇瓶发酵实验51
• 3.3.3 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的5L发酵罐发酵实验51-52
• 3.3.4 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的发酵结果讨论52
• 3.4 菌株GDK-9△gdh△aceA的构建52-54
• 3.4.1 重组片段△aceA的构建52-53
• 3.4.2 重组质粒pK18mobsacB△aceA的构建53
• 3.4.3 重组菌GDK-9△gdh△aceA的构建53
• 3.4.4 重组菌株GDK-9△gdh△aceA的摇瓶发酵实验53-54
• 3.4.5 重组菌株GDK-9△gdh△aceA的5L发酵罐发酵实验54
• 3.4.6 重组菌株GDK-9△gdh△aceA的发酵结果总结54
• 3.5 过表达菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空质粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的构建54-57
• 3.5.1 重组质粒pXMJ19prpc的构建55
• 3.5.2 重组质粒pXMJ19prpc及空质粒pXMJ19的电转化及重组菌株的筛选55-56
• 3.5.3 过表达菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空质粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的摇瓶发酵实验56
• 3.5.4 过表达菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空质粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的5L发酵罐发酵实验56-57
• 3.5.5 基因prpc过表达菌株的发酵实验结果讨论57
• 3.6 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA的双阶段pH和生物素发酵控制57-63
• 3.6.1 重组菌株GDK-9△gdh△gdhA的双阶段pH发酵控制实验58
• 3.6.2 在发酵初期的生物素控制实验58-60
• 3.6.3 在发酵中后期添加生物素对发酵产α-KG的影响60-62
• 3.6.4 双阶段pH和生物素控制条件下的发酵过程62-63
• 4 结论63-65
• 5 展望65-66
• 6 参考文献66-73
• 7 攻读研究生期间论文发表情况73-74
• 8 致谢74

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