L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化

发布时间：2017-09-11 13:13

  本文关键词：L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化

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【摘要】：L-异亮氨酸是八种必需氨基酸之一,在人体代谢中具有重要作用。在L-异亮氨酸的合成过程中,乙酰羟基酸合成酶催化丙酮酸和前体α-酮基丁酸生成L-异亮氨酸。由于乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸亲和性高于丙酮酸,当胞内α-酮基丁酸供应量增加时,乙酰羟基酸合成酶可优先催化生成L-异亮氨酸。同时乙酰羟基酸合成酶是L-异亮氨酸合成途径的限速酶,强化该酶可以加速限速反应,有利于L-异亮氨酸积累。为了研究增加胞内α-酮基丁酸的供应和强化乙酰羟基酸合成酶对L-异亮氨酸发酵的影响,本文以L-异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW为出发菌株进行改造,通过质粒过表达cimA成功构建了C. glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出发菌株基因组ilvB上游插入Ptac强启动子成功构建C. glutamicum YILWPtac;在C. glutamicum YILWPtac基础上质粒过表达cimA,获得C. glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通过RT-PCR分析,cimA和ilvB的转录量分别提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C. glutamicum YILWpXMJ 19cimA可以表达。对出发菌株和改造菌进行摇瓶补料分批发酵比较改造菌产酸水平的变化。结果发现,与出发菌C. glutamicum YILW相比,YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-异亮氨酸积累量提高了8.9%和14.8%,糖酸转化率提高了17.8%和18.6%,单位菌体产酸提高了15.1%和20.3%,副产物L-丙氨酸较原菌分别降低了25.0%和29.9%。Cglutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-异亮氨酸积累量较原菌提高了14.5%,副产物L-丙氨酸较原菌降低了8.6%,糖酸转化率和单位菌体产酸分别提高了42.4%和17.6%,糖酸转化率较YILWpXMJ 19cimA和YILWPtac分别提高了20.8%和20.0%。实验结果表明通过Ptac强启动子插入协同cimA表达增加胞内α-酮丁酸的供应和强化限速酶乙酰羟基酸合成酶的方法可以提高产酸,并能够较明显的提高菌体的糖酸转化率。代谢分析表明L-异亮氨酸合成代谢流从1.09%分别提高到2.33%、7.69%和4.26%。5L发酵罐发酵实验出现菌体在20 h过早地进入稳定期,并表现出生长停滞,耗糖耗氧变慢的情况。针对该现象在发酵过程中依次流加了豆饼水解液、玉米浆、生物素、氨基酸复合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多种营养物质。结果菌体生物量低的问题依然没有解决。通过流加实验排除了流加的成分是菌体生长的限制因素,猜测可能是玉米浆中的某种或某几种未知的营养因子限制菌体生长和产酸。
【关键词】：L-异亮氨酸 α-酮基丁酸 强启动子 流加
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ922
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 1 前言10-26
• 1.1 引言10
• 1.2 L-异亮氨酸的理化性质及应用10-12
• 1.2.1 L-异亮氨酸的理化性质10-11
• 1.2.2 L-异亮氨酸的应用11-12
• 1.3 L-异亮氨酸的生产方法及生产概况12-13
• 1.3.1 L-异亮氨酸生产方法12-13
• 1.3.2 L-异亮氨酸生产概况13
• 1.4 L-异亮氨酸的生物合成途径及调节机制13-17
• 1.4.1 L-异亮氨酸生物合成途径13-14
• 1.4.2 L-异亮氨酸生物合成的调节机制14-17
• 1.5 L-异亮氨酸生产菌的常规育种思路及育种实例17-20
• 1.5.1 常规育种思路17-19
• 1.5.2 常规诱变育种实例19-20
• 1.6 代谢工程理论在构建L-异亮氨酸生产菌中的应用20-22
• 1.6.1 基于代谢工程理论的L-异亮氨酸工程菌的构建思路20
• 1.6.2 分子研究进展20-22
• 1.7 基于α-酮基丁酸节点处的代谢流研究22
• 1.8 利用发酵优化提高L-异亮氨酸发酵生产22-23
• 1.9 论文的立题背景和研究内容23-26
• 1.9.1 立题背景23-24
• 1.9.2 本论文的主要研究内容24-26
• 2 材料与方法26-44
• 2.1 实验材料26
• 2.1.1 菌株26
• 2.2 主要仪器和试剂26-32
• 2.2.1 主要仪器27
• 2.2.2 主要试剂27-29
• 2.2.3 主要溶液29-32
• 2.3 实验方法32-44
• 2.3.1 质粒提取32
• 2.3.2 基因组小量提取32-33
• 2.3.3 DNA限制性内切酶酶切33
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳33-34
• 2.3.5 DNA的回收纯化34
• 2.3.6 连接与化转34-35
• 2.3.7 感受态细胞制备及电转化35-36
• 2.3.8 PCR扩增36-37
• 2.3.9 转化子鉴定37
• 2.3.10 目的基因测序转化子鉴定37
• 2.3.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳37-38
• 2.3.12 RT-qPCR实验38-39
• 2.3.13 谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的培养条件及测定方法39-40
• 2.3.14 高效液相色谱法定量检测发酵液中的氨基酸浓度40-41
• 2.3.15 代谢流量分析41-44
• 3 结果与讨论44-71
• 3.1 谷氨酸棒状杆菌表达载体pXMJ19cimA的构建44-45
• 3.1.1 cimA基因的扩增44
• 3.1.2 表达载体pXMJ19cimA的构建44-45
• 3.2 C.glutamicum YILWpXMJ19cimA的构建45
• 3.3 谷氨酸棒状杆菌整合载体pK18mobsacBPtac的构建45-48
• 3.3.1 tac的扩增45-46
• 3.3.2 插入tac序列的同源序列构建46-47
• 3.3.3 谷氨酸棒状杆菌整合载体pK18mobsacBPtac的构建47-48
• 3.4 C.glutamicum YILWPtac的构建48-51
• 3.4.1 整合载体pK18mobsacBPtac电转整合C glutamicum YILW48-49
• 3.4.2 C.glutamicum YILWPtac的筛选49-51
• 3.5 C.glutamicum YILWPtacpXMJl9cimA的构建51
• 3.6 cimA编码蛋白的表达和Ptac强启动子的影响51-54
• 3.6.1 cimA编码的异源蛋白在C.glutamicum YILWpXMJl9cimA中表达51-53
• 3.6.2 Ptac强启动子对C.glutamicum YILWPtac中ilvB转录的影响53-54
• 3.7 L-异亮氨酸分批发酵研究54-57
• 3.7.1 cimA异源表达对C.glutamicum YILWpXMJ19cimA发酵的影响54-56
• 3.7.2 启动子Ptac插入对C.glutamicum YILWPtac发酵的影响56
• 3.7.3 启动子Ptac插入协同cimA表达对L-异亮氨酸发酵的影响56
• 3.7.4 cimA表达与启动子Ptac插入对L-异亮氨酸发酵中副产物的影响56-57
• 3.8 cimA表达协同启动子Ptac插入对L-异亮氨酸发酵影响的讨论57-58
• 3.9 5L发酵罐分批发酵研究58-60
• 3.10 代谢流分布比较60-62
• 3.11 分批发酵优化62-70
• 3.11.1 碳源的优化63
• 3.11.2 氮源的优化63-69
• 3.11.3 其它营养要素的优化69
• 3.11.4 综合多营养策略优化69-70
• 3.12 发酵优化小结70-71
• 4 结论71-72
• 5 展望72-73
• 6 参考文献73-79
• 7 研究生期间发表论文情况79-80
• 8 致谢80

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