耐乙醇巴氏醋杆菌选育及其耐受机制

发布时间：2017-09-21 09:05

  本文关键词：耐乙醇巴氏醋杆菌选育及其耐受机制

  更多相关文章： 巴氏醋杆菌 等离子体诱变 乙醇耐受性 代谢组学 脂肪酸

【摘要】：醋酸菌在醋酸发酵过程中不可避免地受到乙醇、乙酸和高温等环境因素胁迫,严重影响产量,同时增加生产成本。乙醇作为醋酸菌的发酵底物,不仅影响食醋的产量,还会影响醋酸菌自身的生长。本文利用等离子体诱变(ARTP)对常用的食醋酿造菌巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)进行诱变,获得了一株乙醇耐受株。而后对该菌的发酵特性、细胞膜通透性、海藻糖含量、胞内代谢物及细胞膜脂肪酸组成变化进行研究,初步探讨了巴氏醋杆菌乙醇耐受机制,为定向改造菌种提供依据。首先,通过ARTP诱变成功选育出一株乙醇耐受菌株,命名为T3-06。该诱变株遗传性状稳定,在含有11%(v/v)乙醇发酵培养基中醋酸产量为33.38±2.73g/L,比出发菌株提高了380.98%。对菌株T3-06和AP1.01细胞膜通透性和海藻糖含量比较表明,菌株T3-06的细胞膜通透性要小于APl.01,且其细胞中海藻糖的合成量要高于APl.01。细胞膜通透性大小和海藻糖合成量对菌株的乙醇耐受性有影响。利用基于GC-MS代谢组学对T3-06耐受机制进行研究,结果表明乙醇胁迫下T3-06细胞中碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢相关物质含量发生了改变。乙醇胁迫下菌株的糖酵解途径和三羧酸循环被抑制,但此时菌株T3-06的乙醇产能途径在该条件下能够很好地运作,氧化乙醇使得细胞内有足够的能量供应,维持细胞生长,来抵抗外界不利因素。菌体内合成了众多细胞活性保护物质,如脯氨酸、亮氨酸和海藻糖等。细胞膜脂肪酸组成测定表明乙醇胁迫使得菌体中饱和脂肪酸的合成受到抑制,不饱和脂肪酸含量增加,使得饱和脂肪酸／不饱和脂肪酸比值减小,细胞膜流动性增加。同时,DPH荧光探针测定也验证了细胞膜流动性的变化。在乙醇胁迫下菌株T3-06能够有效地调节自身脂肪酸的合成,减小膜的流动性。乙醇胁迫下T3-06细胞膜脂肪酸的调节主要是通过调节十六烷酸、十八烷酸和亚油酸的合成量。综上可知与出发株AP1.01相比,诱变株T3-06乙醇耐受的原因为：高乙醇浓度下T3-06乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶仍能保持较高的活力保证了乙醇呼吸链的产能,并且T3-06能够有效地调节菌体内的碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢同时合成细胞活性保护物质,调节自身细胞膜脂肪酸组成维持细胞膜一定的流动性。
【关键词】：巴氏醋杆菌 等离子体诱变 乙醇耐受性 代谢组学 脂肪酸
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ223.122;TQ920.1
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-17
• 1.1 醋酸菌简介8
• 1.2 耐乙醇醋酸菌的选育和改造8-9
• 1.3 乙醇耐受机制研究9-11
• 1.3.1 细胞膜磷脂与乙醇耐受性10
• 1.3.2 海藻糖与乙醇耐受性10-11
• 1.3.3 通用应激机制与乙醇耐受性11
• 1.4 室温等离子体诱变技术11-13
• 1.4.1 室温等离子体诱变技术简介11-12
• 1.4.2 室温等离子体诱变技术特点12
• 1.4.3 室温等离子体诱变技术的应用12-13
• 1.5 代谢组学13-15
• 1.5.1 代谢组学概述13-14
• 1.5.2 统计学分析方法14-15
• 1.5.3 代谢组学的应用15
• 1.6 论文研究内容与意义15-16
• 1.7 技术路线16-17
• 2 材料与方法17-33
• 2.1 实验材料17-21
• 2.1.1 实验菌株17
• 2.1.2 试剂与仪器17-19
• 2.1.3 培养基19
• 2.1.4 溶液配制19-21
• 2.1.5 巴氏醋杆菌培养方法21
• 2.2 实验方法21-28
• 2.2.1 巴氏醋杆菌在不同乙醇浓度下的生长情况21
• 2.2.2 巴氏醋杆菌等离子体诱变21-23
• 2.2.3 诱变株和出发株乙醇下的生理响应23-25
• 2.2.4 胞内小分子代谢物分析比较25-26
• 2.2.5 细胞膜脂肪酸组成比较26-28
• 2.3 分析方法28-33
• 2.3.1 产酸量测定28-29
• 2.3.2 发酵液葡萄糖酸含量测定29
• 2.3.3 乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶酶活测定29-30
• 2.3.4 ATP水解酶酶活测定30-31
• 2.3.5 菌体干重测定31-33
• 3 结果与讨论33-69
• 3.1 巴氏醋杆菌AP1.01在不同乙醇浓度下的生长情况33-34
• 3.2 巴氏醋杆菌等离子体诱变34-38
• 3.2.1 等离子体诱变致死率曲线34-35
• 3.2.2 乙醇耐受菌株的筛选35-37
• 3.2.3 诱变菌株遗传稳定性实验37-38
• 3.2.4 小结38
• 3.3 诱变株和出发株在乙醇下的生理响应比较38-47
• 3.3.1 诱变株和出发株发酵性能比较38-42
• 3.3.2 乙醇对诱变株和出发株细胞膜通透性影响42-46
• 3.3.3 乙醇对诱变株和出发株海藻糖含量影响46-47
• 3.3.4 小结47
• 3.4 诱变株和出发株胞内小分子代谢物分析比较47-63
• 3.4.1 胞内代谢物的检测与定性定量分析48-49
• 3.4.2 诱变株和出发株胞内代谢物多元统计分析49-63
• 3.4.4 小结63
• 3.5 诱变株和出发株细胞膜脂肪酸组成比较63-69
• 4 结论69-70
• 5 展望70-71
• 6 参考文献71-79
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况79-80
• 8 致谢80

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