LRRFIP1基因干扰预防骨科深静脉血栓形成的实验研究

【摘要】 研究背景：深静脉血栓形成是骨科临床常见并发症之一，好发于下肢骨折患者，如血栓脱落可引起致命性肺栓塞，晚期常遗留静脉炎综合征，严重影响患者的康复及生命安全。新近有研究表明富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1（LRRFIP1）可能与血栓的形成有重要联系。LRRFIP1基因及其编码的蛋白质，通过与血小板细胞膜上表达的相关蛋白相互作用，血小板细胞骨架的结构进而发生改变，影响血小板的凝血功能并导致血栓的形成。因此我们拟通过RNA干扰技术靶向沉默LRRFIP1基因，并建立动物模型，观察LRRFIP1基因对深静脉血栓形成的影响，探讨LRRFIP1基因沉默对预防骨科深静脉血栓形成的效果，为最终应用于在体基因治疗深静脉血栓提供相关实验依据。研究方法：1、LRRFIP1基因RNAi慢病毒载体的构建设计并合成LRRFIP1基因靶向的双链DNA：根据GenBank报道的小鼠LRRFIP1基因序列，通过将Ambion公司的设计软件与RNA干扰序列的设计原则相结合，设计出3对针对LRRFIP1基因shRNA的寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染293T细胞，RT-PCR和western blot测定沉默效率，使用沉默效率最高的质粒构建LRRFIP1基因RNAi的慢病毒载体。2、小鼠骨髓细胞原代分离与培养将1周龄的新生小鼠消毒后处死，分离骨髓细胞，接种于无菌培养瓶，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。3、小鼠骨髓细胞慢病毒感染在24孔培养板接种若干孔，将3⁵X104个目的细胞接种至每个孔内，50%左右细胞的贴壁率应在铺板时达到，每孔培养基体积为100μl；70%左右的细胞贴壁率应在进行病毒感染时达到。感染96小时后，在荧光倒置显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。4、动物分组与给药将健康成年雄性ICR小鼠（20±2g）随机分为：1)正常对照组（control）；2)假手术组（sham）：不给药；3)低分子肝素（LMWH）治疗组（LMWH）：术前通过尾静脉注射LMWH一次(2000U·kg^-1)，术后每日注射一次LMWH (2000U·kg^-1·d^-1)；4)模型组（model）：术前、术后每日注射等体积生理盐水；5) LRRFIP1shRNA治疗组（shRNA）：术前注射LRRFIP1shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×10⁷cells/mouse）；6)阴性shRNA治疗组（Negative shRNA）：术前注射LRRFIP1阴性对照shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×10⁷cells/mouse）；采用下腔静脉结扎法制作小鼠深静脉模型。分别于术后第1、3、7天每组处死6只小鼠。称量血栓重量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清p选择素及D二聚体水平，Western blot检测血栓中LRRFIP1蛋白的表达。5、统计分析计量资料表示为means±S.D。采用SPSS17.0for Windows进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Fisher LSD分析。以p<0.05作为有统计学差异。结果：1.成功构建了携LRRFIP1shRNA的慢病毒载体，LRRFIP1shRNA转染后LRRFIP1基因及蛋白表达均显著降低；2. LRRFIP1shRNA显著抑制血栓中LRRFIP1蛋白表达。在模型组中，在术后第1、3、7天血栓中LRRFIP1蛋白的表达显著降低（P<0.01）。在所观察的3个时间点上，使用LRRFIP1shRNA处理可以进一步抑制LRRFIP1在血栓中的表达，提示LRRFIP1shRNA慢病毒在体内可以有效抑制LRRFIP1的表达。但低分子肝素和阴性shRNA对LRRFIP1表达无影响。3. LRRFIP1shRNA显著抑制小鼠下肢静脉血栓形成。LRRFIP1shRNA抑制体内血栓形成明显的。在术后第7天，模型组小鼠血栓重量为8.63±0.40mg，在LRRFIP1shRNA治疗组，血栓重量降低到2.15±0.57mg （P<0.01）。血栓形成抑制率为75.10%。而在低分子肝素治疗组和阴性shRNA治疗组，血栓重量分别为2.20±0.33mg和6.47±0.66mg，血栓形成抑制率分别为74.50%and25.02%。4. LRRFIP1shRNA能够降低小鼠血清p-选择素和d-二聚体水平。与正常对照组和假手术组相比，模型组血浆P-选择素水平明显增加（P<0.01）。LRRFIP1shRNA治疗显着降低血浆P-选择素水平（P<0.01）。血浆D-二聚体水平在模型组也明显升高（P<0.01），而LRRFIP1shRNA治疗可显著地抑制D-二聚体水平的上调（P<0.01）。然而，低分子肝素和阴性shRNA对血浆P-选择素、D-二聚体水平的影响不大。结论：1.成功构建了LRRFIP1shRNA表达质粒及慢病毒载体；2. LRRFIP1shRNA在体内、外均能够抑制LRRFIP1mRNA和蛋白表达；3. LRRFIP1基因干扰能抑制小鼠下肢深静脉血栓形成；4. LRRFIP1shRNA抑制深静脉血栓形成与其降低血浆p-选择素和d-二聚体水平有关。 

第一章   前     言  

深静脉血栓(DVT)形成是骨科临床常见并发症之一，好发于下肢骨折患者。血栓好发于下肢深静脉，以髂静脉、股静脉多见。如血栓脱落可引起致命性肺栓塞，晚期常遗留静脉炎综合征，包括遗留肿胀、淤积性皮炎、迁延不愈的小腿溃疡等等，病情严重者具有截肢的可能，严重影响患者的康复及生命安全。但骨科临床在对深静脉血栓形成经过正规预防后：如物理预防及药物预防措施后仍有约 20%的下肢骨折与大关节置换患者存在 DVT，具体的发病机制仍不清楚。 

新近有研究表明富亮氨酸重复序列相互作用蛋白 1(LRRFIP1)可能与血栓的形成有重要联系。研究者通过一项对 500 名受试者的研究分析发现，LRRFIP1 基因及其编码的蛋白质，通过与血小板细胞膜上表达的相关蛋白相互作用，血小板细胞骨架的结构进而发生改变，从而影响血小板的凝血功能并导致血栓的形成。因此我们通过 RNA干扰技术靶向沉默 Lrrfip1 基因，并建立动物模型，观察 Lrrfip1 基因对深静脉血栓形成的影响，探讨 Lrrfip1 基因沉默对预防骨科深静脉血栓形成的效果，为最终应用于在体基因治疗深静脉血栓提供相关实验依据。 

近年来，随着社会的快速进步与发展，骨创伤患者越来越多，以及随着骨科大手术的广泛开展，如：人工全髋关节置换术(total hip replacement，THR)、人工全膝关节置换术(total knee replacement，TKR)和髋部周围骨折手术(hip fractures surgery，HFS)，静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)的报道也日益增多。静脉血栓栓塞症包 括 深 静 脉 血 栓 形 成 (deep  vein  thrombosis ， DVT) 和 肺 栓 塞 (pulmonary thromboembolism，PTE)，这是 VTE 在肢体不同部位和不同阶段的两种临床表现形式。骨科临床中 DVT 发生率较高，是临床上引起并发症和死亡的一个重要原因。国外研究表明，在 THR 病人中 DVT 的发生率为 42~57%，PTE 的发生率为 0.9~28%，致死性 PTE 的发生率为 0.1~2%；在 TKR 病人中 DVT 的发生率为 41~85%，PTE 的发生率为 1.5~10%，致命性 PTE 的发生率为 0.1~1.7%；在 HFS 病人中 DVT 的发生率为46~60%，PTE 的发生率为 3~11%，致命性 PTE 的发生率为 0.3~7.5%；一项亚洲国家多中心的研究结果显示：骨科大手术后深静脉血栓形成发生率为 43.2%。国内相关临床研究报告骨科大手术后深静脉血栓形成发生率为 20.6~47.1%。 

1884 年，Virchow 等人提出引起血栓形成的三个条件：血管内皮细胞的损伤，血流状态的改变，血液凝固性的增加。其中血小板的激活在血栓形成过程中起着非常重要的作用。血小板产生于来自于骨髓中的成熟的巨核细胞，巨核细胞成熟后，它的细胞膜表面会有血多凹陷形成，互相临近的凹陷的细胞膜在凹陷部位的深部相互发生融合，紧接着巨核细胞的一部分胞质会与巨核细胞母体分离开来，最终这些成分将从巨核细胞上脱离，通过血窦进入机体血液循环成为血小板。血小板的主要功能是促进止血和加速凝血，同时维护毛细血管壁的完整性是其另外一个重要的功能，当血管破损时，损伤部位激活因素刺激血小板，使得血小板聚集在血管破损部位，成为富含血小板的凝块，接着血小板又会形成凝血酶，这些凝血酶将会刺激周围血浆组织中的纤维蛋白原，促使其演变为纤维蛋白，这些相互交织的纤维蛋白会包裹血小板凝块，继而这些血小板凝块与血细胞缠结在一起最终成为血凝块，即形成血栓。另一方面血小板表面的突起会伸出进入纤维蛋白网内，血小板肌动蛋白和收缩后的肌球蛋白会使已经形成的血凝块收缩，形成更为坚实的血栓，更有效地起到止血作用。血小板被激活后还能释放血栓素 A2、致密颗粒和 α 颗粒、ADP、5-羟色胺、血小板第 4 因子、β 血栓球蛋白、凝血酶敏感蛋白、细胞生长因子、血液凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅻ和血管通透因子等等，以上这些活性物质会通过激活相邻的血小板、促血管收缩、促纤维蛋白形成等多种形式加强止血效果。有学者认为，凝血因子 V 的变异可能与 DVT 的发生有关。凝血因子 V 是一种糖蛋白，在机体凝血过程中处于内外源性凝血途径的交叉点，凝血因子V能够加速和促进凝血酶原的激活和生成凝血酶，若凝血因子V发生基因突变后，则称为因子 V Leiden，静脉血栓形成的常见危险因素就是凝血因子 V 发生基因突变。有研究通过对国外 2063 位手术或创伤后深静脉血栓形成的患者进行检测凝血因子 V后发现，30%的病人发生变异而成为因子 V Leiden。

第二章  LRRFIP1 基因 RNA 干扰慢病毒载体的构建及 转染效率的鉴定  

2.1 实验材料 

2.1.1  菌株与质粒 

2.1.1.1  实验菌株   

◆ Escherichia coli DH5α 

2.1.1.2  表达质粒  GFP 蛋白表达载体 pGCL-GFP 

2.1.2  主要酶类与分子量标准 

◆ Taq DNA polymerase(TaKaRa) 

◆ Pfu DNA polymerase(TaKaRa) 

◆ T4 DNA Ligase(Roche) 

◆  限制性内切酶 Hpa I、Xho I(TaKaRa) 

◆ 1kb DNA Ladder(MBI Fermentas) 

◆ DNA Ladder，Mix(MBI Fermentas) 

◆ 100bp O’ Gene Ruler(MBI Fermentas) 

◆ DL2000 DNA Marker(TaKaRa) 

◆  蛋白质中范围分子量预染 Marker(Thermo Scientific) 

◆  蛋白质宽范围分子量预染 Marker(Thermo Scientific) 

2.1.3  主要抗体与试剂盒 

◆  兔抗鼠 LRRFIP1 多克隆抗体(Sigma-Aldrich) 

◆ HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体(上海联科生物公司) 

◆  小量质粒抽提纯化试剂盒(QIGEN) 

◆  大量质粒抽提纯化试剂盒(QIGEN) 

◆  小量胶回收试剂盒(QIGEN) 

◆ PCR 试剂盒(Toyobo) 

2.1.4  试验所需主要试剂及配制方法 

2.1.4.1  培养基及其所需试剂 

◆ LB 液体培养基：准确称重 10g 胰化蛋白胨(tryptone, Oxoid)，5g 酵母提取物(yeast extract, Oxoid)，950ml ddH2O 中加入 10g 氯化钠，充分摇动使之完全、充分溶解，使用 1mol/L NaOH 调节溶液 pH 值至 7.0，定容至 1000ml，在 1.034×105Pa 高压蒸汽灭菌备用，灭菌时间为 20min(使用前通过加入 100mg/ml 氨苄青霉素调节终浓度为100μg/ml)。 

◆ 2% LB 固体培养基：准确称取 2g 的琼脂粉加入至 100ml LB 液体培养基中，高压蒸汽灭菌消毒，灭菌时间为 20min。自高压灭菌器中取出灭菌后的培养基，轻轻旋动培养基，使琼脂均匀地溶解至整个培养基溶液中，静置后使得培养基的温度降至50℃左右后，通过加入 100mg/ml 氨苄青霉素至固体培养基中，调节其终浓度为100μg/ml，然后从保存烧瓶中直接倾倒出培养基，进而铺制平板。 

◆ 100mg/ml 氨苄青霉素溶液：5ml ddH2O 中加入氨苄青霉素 500mg，使用 0.22μm孔径滤膜过滤，达到除菌目的，然后进行分装置于-20℃条件保存。 2.1.4.2  琼脂糖凝胶电泳所用试剂 

◆ 50×TAE 电泳缓冲液：准确称重 Tris 碱 242 g，冰乙酸 57.1 ml，所需 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)  100  ml，加入 ddH2O 将其定容至 1000  ml，保存条件为避光，使用时需按 1∶50 浓度进行稀释。 

2.2 实验方法 

2.2.1 LRRFIP1 基因 RNAi 慢病毒载体的构建： 

2.2.1.1 设计并合成 LRRFIP1 基因靶向的双链 DNA：根据 GenBank 报道的小鼠LRRFIP1 基因序列，通过采用 Ambion 公司的设计软件与 RNA 干扰序列的设计原则相结合，设计出 3 对针对 LRRFIP1 基因 shRNA 的寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染 293T 细胞； 

2.2.1.1.1 LRRFIP1 shRNA 表达质粒的构建  Hpa I 和 Xho I 酶切 pGCL-GFP 载体以使其线性化； 酶切产物的回收，使用小量胶回收试剂盒，将 pGCL-GFP 载体酶切产物回收纯化，具体操作方法如下： 

(1)水平电泳后，割下约 200mg 左右的包含目的条带的低熔点琼脂糖块，置于 1.5ml离心管中。 

(2)加入 600 微升  S1 液，置于 55℃水浴中 10 分钟，每 2 分钟颠倒混匀一次，完全溶化琼脂糖块。 

(3)将完全溶化后的凝胶溶液移至入吸附柱内，12000rpm 离心，离心时间为 1 分钟，将收集管里面的液体倒掉，再将吸附柱放入同一个收集管中。 

(4)将 500?l W1 液(已加无水乙醇)加入吸附柱中，12000rpm 离心，离心时间为 15秒，然后将收集管中的液体倒掉，将吸附柱置入同一个收集管中。 

(5)在吸附柱中加入 500?l W1 液(已加无水乙醇)，静置 1 分钟后，12000rpm，离心15s。将收集管里面的液体倒掉，再将吸附柱放入同一个收集管中。 

(6)12000rpm，离心时间为 1 分钟。 

(7)将吸附柱放入一个干净的 1.5ml 的离心管中，将 30?l 的 T1 液加入吸附膜中央，静置 1 分钟后，12000rpm 离心，离心时间 1 分钟，洗脱液-20℃条件下进行贮存。 

目的片段与载体的连接，经退火形成的双链 DNA，在与双酶切后的 pGCL-GFP载体相互连接结合，连接反应体系：其中包括酶切回收的载体脱氧核糖核酸(100 ng/μL)1μL，退火的双链脱氧核糖核酸(100 ng/μL)1μL, 10×T4 噬菌体脱氧核糖核酸连接酶缓冲液 1μL，T4 噬菌体脱氧核糖核酸连接酶 1μL, ddH2O 6μL，于 4℃条件下 12 小时连接反应制备克隆连接液，准备转化；  37℃条件下振摇 16 小时转化到 DH5α。 

第三章  小鼠骨髓细胞慢病毒感染及深静脉血栓动物模型的建立.........27 

3.1 试验材料 ................27 

3.2 试验方法 ............27 

3.3 试验结果 ..............29 

3.4 小     结 ..................34 

3.5 讨     论 ................34 

第四章  LRRFIP1 基因干扰对小鼠深静脉血栓形成的作用...................37 

4.1 实验材料 ............37 

4.2 实验方法 ...................37 

4.3  实验结果 ..................42

4.4 小     结 ................45 

4.5 讨     论 ....................45 

全文总结.................50 

第四章  LRRFIP1 基因干扰对小鼠深静脉血栓形成的作用  

4.1 实验材料 

4.1.1  实验动物 

1 周龄的小鼠 134 只(由第三军医大学动物中心提供)。 

4.1.2  实验器材 ? 高速冷冻离心机  

细胞培养箱(艾普瑞) 

超净工作台(苏州三兴净化) 

普通显微镜(尼康) 

37℃水浴锅 ? 荧光倒置显微镜(尼康)。 

4.1.3  主要试剂 

PBS 溶液(粉末，溶液配制好后需要在高压灭菌锅内灭菌)

DMEM/F12 培养基(购至 GIBCO) 

胎牛血清(购至 Hyclone) 

双抗(青霉素、链霉素) 

胰酶(北京赛驰生物，使用时浓度为 0.25%，含 0.02%EDTA，制备时即取 250mg胰酶和 20mgEDTA 溶于 100mLPBS 溶液，并在无菌操作台上用一次性过滤器过滤)

BIZOL 保存液(碧云天) 

红细胞裂解液(碧云天) 

慢病毒 GPH-Lrrfip-sh1(滴度 1×109TU/ml，100 μl) 

慢病毒阴性对照(滴度 2×109 TU/ml，250 μl) 

4.2 实验方法 

.2.1  小鼠骨髓细胞原代分离与培养 

4.2.1.1  将 1 周龄的新生小鼠 8 只装在 250mL 烧杯中带入细胞培养室内，先用酒精棉球擦洗乳鼠，用大镊子夹其颈部致死，然后把整个动物浸入盛有 75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出用大头针固定在泡沫板上。先用碘酒擦洗胸腹部，再用酒精擦洗，用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出小鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS 溶液冲洗两遍。8 只乳鼠均按以上操作。 

4.2.1.2  用无菌消毒的剪刀从中折断骨头，用 1ml 无菌注射器吸取 PBS 溶液冲洗骨髓细胞多次，再用针头吹打，最后用吸管吸入离心管内，1000r/min 离心 5min，弃上清。 

全文总结  

1.  成功构建的 LRRFIP1 shRNA 在体外能够抑制 LRRFIP1 mRNA 和蛋白表达； 

2. LRRFIP1 shRNA 慢病毒在体内能抑制 LRRFIP1 蛋白表达； 

3. LRRFIP1 基因干扰能抑制小鼠下肢深静脉血栓形成；

4.  LRRFIP1  shRNA 抑制深静脉血栓形成与其降低血浆 p-选择素和 d-二聚体水平有关。  
 

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