菊糖果糖转移酶晶体结构及超高压对其构象和功能影响

发布时间：2017-10-13 16:34

  本文关键词：菊糖果糖转移酶晶体结构及超高压对其构象和功能影响

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【摘要】：菊糖果糖转移酶(IFTase)是生物法催化底物菊糖生成新型的功能性食品配料双果糖苷III(DFAIII)的关键酶。目前,关于IFTase的研究多为野生菌的筛选,对于酶的结构了解甚少。蛋白的结构决定其功能,酶的催化功能是以酶分子高度特异性的结构为基础实现的。因此,为了更好的提升IFTase的催化水平,促进对IFTase更深入的研究,有必要从分子水平上对IFTase的结构进行深入的探讨。对IFTase结构的研究,不仅有助于加深对IFTase催化机理以及构效关系的理解,也有利于为以后IFTase理性设计、改造修饰提供理论基础。本论文制备了IFTase以及IFTase-蔗果五糖复合物晶体,并对其空间结构进行了分析;其次在此基础上,利用超高压技术诱导IFTase构象发生变化,调控IFTase酶活、热稳定性等相关酶学性质,并探讨构效关系。主要研究内容和结果如下:(1)利用坐滴法制备了IFTase晶体。最终筛选得到的晶体生长条件为:0.2 mol/L一水合硫酸锂,Tris-HCl缓冲液(0.1 M,p H 8.5),聚乙烯乙二醇3350(25%,w/v)。晶体大小为0.4×0.3×0.2 mm。衍射最终分辨率为2.15?。IFTase每个不对称单元中含有三个基本相同的单体分子,并组成了一个三聚体。此三聚体通过每个亚基上Ser 293以及Ser 269之间两两形成的分子间氢键而稳定。IFTase单体呈锥形,主要是由β-折叠所构成。和已报道的IFTase结构不同的是,每个IFTase分子有三处位置可以和7个底物分子GF4相结合。其中,Asp 169以及Gln 216可能是GF4分子中葡萄糖单元的结合位点或者识别位点。Trp 103上苯环和另一个亚基上Pro 133之间形成了π-σ共轭键,以稳定IFTase分子及活性口袋。将IFTase中半胱氨酸突变成丙氨酸后,检测其在80℃下热稳定性,实验发现Cys 144、Cys 205、Cys 208对于IFTase热稳定性影响更为显著。(2)利用超高压技术处理IFTase酶溶液,对其构象及催化功能变化进行研究。IFTase经不同强度压力处理后发现,在最适温度60℃,200 MPa下处理15 min后,IFTase酶活略微升高13.6%。而随着处理压力强度提升,IFTase酶活逐渐降低。当处理压力为600MPa时,残余酶活仅为4.56%。此时,如果添加3 mol/L山梨糖醇能够使IFTase酶活提高3.88倍,此实验结果表明高浓度山梨糖醇能够提高IFTase在高压下的稳定性。卸压后,经低压处理后IFTase酶活具有回复性,而较高压力处理后IFTase失活不可逆。另外,在200 MPa下IFTase热稳定性显著提高。在80℃,在常压下保温25 min后,酶活仅剩余50.5%,而在200 MPa,80℃保温25 min后,酶活还能保留约70%,IFTase热失活速率常数可以降低55.9%,而失活活化能能提高1.41倍。采用圆二色谱、内源荧光光谱、荧光探针技术、分子筛、电泳、动态光散射、原子力显微镜等方法考察经不同压力处理后,IFTase构象的变化。研究发现,IFTase一级结构并没有发生明显的变化,而二级结构逐渐遭到了破坏。色氨酸的微环境变化则较为复杂。当处理压力小于200 MPa时,色氨酸微环境更趋向于疏水。此时,IFTase整体构象变化较少,某些局部区域如Loop环由于柔性较大,更易受到压力的影响。Loop环构象的变化可能会导致IFTase酶活发生变化。在较低压力下,Loop环可能更为致密有序,将进一步稳定活性口袋。这种构象变化“有利效应”抵消了压力导致的“不利效应”,从而造成酶活在低压下略微增加。而当压力进一步增大时,色氨酸和水分子更容易接触,分子表面疏水性增大,并且此时,IFTase三聚体发生解离,平均粒径下降,亚基之间的分子间氢键、不同亚基间Pro 133和Trp 103形成的π-σ共轭键发生断裂。IFTase刚性结构遭到破坏,从而造成IFTase在高压下稳定性降低,酶活丧失。而当添加山梨糖醇时,可能由于其能提供较多的氢键,从而稳定了蛋白构象。压力处理和温度处理对其构象作用机制有所不同。经200 MPa压力处理15 min后,IFTase中分子内二硫键含量增加。二硫键增多可以使IFTase热稳定性提高,但这并不是唯一因素。超高压处理后,非共价键的变化也对改善酶热稳定性起了至关重要的作用。(3)在了解IFTase经超高压处理后其构象及酶学性质变化的基础上,利用超高压技术考察IFTase催化水解菊糖反应体系,研究超高压下IFTase催化热动力学机制。研究发现,IFTase最适催化条件为:反应压力200 MPa,反应温度60℃,此时米氏常数、活化能、活化焓、活化体积最低,周转数、催化效率最高。在200 MPa下,IFTase最适反应p H为6.0,比常压下提高0.5个单位。1.5 mol/L的Na Cl能进一步加快IFTase在高压下的催化速度,而1.5 mol/L的Na NO3却起着相反的效果。
【关键词】：菊糖果糖转移酶 晶体结构 超高压 构象变化 催化行为
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.25
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-27
• 1.1 引言11
• 1.2 菊糖果糖转移酶概述11-15
• 1.2.1 菊糖果糖转移酶微生物来源及性质11-13
• 1.2.2 菊糖果糖转移酶结构及催化机制13-15
• 1.3 调控酶活性的物理化学以及生物学方法15
• 1.4 超高压生物技术研究进展15-17
• 1.4.1 超高压生物技术概念、特点及其发展15-16
• 1.4.2 超高压生物技术应用16-17
• 1.5 超高压对酶影响及其可能作用机制17-21
• 1.5.1 超高压对酶催化能力影响17-19
• 1.5.2 超高压对酶热稳定性影响19
• 1.5.3 超高压对酶构象影响19-20
• 1.5.4 超高压作用酶分子机制20-21
• 1.6 酶结构研究方法21-25
• 1.6.1 结晶衍射法21-23
• 1.6.2 光谱技术23-24
• 1.6.3 分子动力学模拟24-25
• 1.7 本课题立题依据、研究意义及主要研究内容25-27
• 1.7.1 立题依据和研究意义25
• 1.7.2 本论文研究内容25-27
• 第二章 IFTase晶体结构27-43
• 2.1 引言27
• 2.2 材料与方法27-30
• 2.2.1 主要试剂27
• 2.2.2 主要仪器27
• 2.2.3 IFTase制备及分离纯化27-28
• 2.2.4 蛋白纯度鉴定28
• 2.2.5 蛋白浓度确定28-29
• 2.2.6 酶活测定29
• 2.2.7 结晶方法29
• 2.2.8 X-衍射晶体数据收集及结构解析与模型修正29
• 2.2.9 定点突变29-30
• 2.2.10 IFTase及突变体热稳定性检测30
• 2.2.11 数据处理30
• 2.3 结果与讨论30-41
• 2.3.1 IFTase制备与分离纯化30-31
• 2.3.2 结晶条件筛选以及衍射数据收集31-33
• 2.3.3 IFTase及IFTase-GF4复合物结构分析33-37
• 2.3.4 讨论37-41
• 2.4 本章小结41-43
• 第三章 超高压下IFTase的活性和构象43-62
• 3.1 引言43
• 3.2 材料与方法43-47
• 3.2.1 主要试剂43-44
• 3.2.2 主要仪器44
• 3.2.3 超高压处理IFTase溶液44
• 3.2.4 不同温度处理IFTase溶液44
• 3.2.5 盐酸胍处理IFTase溶液44
• 3.2.6 酶活测定44
• 3.2.7 SDS-PAGE44
• 3.2.8 圆二色谱（CD）44-45
• 3.2.9 内源荧光45
• 3.2.10 表面疏水性45
• 3.2.11 体积排阻色谱45-46
• 3.2.12 粒径分析46
• 3.2.13 原子力显微镜（AFM）46
• 3.2.14 LC-MS46
• 3.2.15 分子动力学模拟46-47
• 3.2.16 数据处理47
• 3.3 结果与讨论47-61
• 3.3.1 超高压处理对IFTase酶活影响47-49
• 3.3.2 超高压处理对IFTase构象影响49-58
• 3.3.3 压力处理、温度处理、变性剂处理后IFTase构象比较58-61
• 3.4 本章小结61-62
• 第四章 山梨糖醇对IFTase高压稳定性的调节62-69
• 4.1 引言62
• 4.2 材料与方法62-63
• 4.2.1 主要试剂62
• 4.2.2 主要仪器62
• 4.2.3 IFTase-糖/糖醇复合物制备62-63
• 4.2.4 超高压处理方法63
• 4.2.5 酶活测定63
• 4.2.6 粘度测定63
• 4.2.7 水分活度确定63
• 4.2.8 圆二色谱63
• 4.2.9 内源荧光63
• 4.2.10 紫外吸收光谱63
• 4.2.11 数据处理63
• 4.3 结果与讨论63-68
• 4.3.1 不同种类糖及浓度对IFTase压力稳定性影响63-64
• 4.3.2 山梨糖醇对IFTase构象稳定作用64-66
• 4.3.3 可能机制分析66-68
• 4.4 本章小结68-69
• 第五章 超高压下IFTase的热稳定性69-79
• 5.1 引言69
• 5.2 材料与方法69-71
• 5.2.1 主要试剂69
• 5.2.2 主要仪器69-70
• 5.2.3 高压高温处理IFTase70
• 5.2.4 超高压下热失活及热失活动力学70
• 5.2.5 IFTase酶活测定70
• 5.2.6 圆二色谱70
• 5.2.7 内源荧光70
• 5.2.8 原子力显微镜70
• 5.2.9 体积排阻色谱70
• 5.2.10 二硫键含量测定70-71
• 5.2.11 SDS-PAGE71
• 5.2.12 β-巯基乙醇对IFTase影响71
• 5.2.13 数据处理71
• 5.3 结果与讨论71-78
• 5.3.1 超高压提高IFTase热稳定性作用71-73
• 5.3.2 超高压处理后IFTase构象分析73-76
• 5.3.3 讨论：分子机制76-78
• 5.4 本章小结78-79
• 第六章 超高压下IFTase的催化反应79-90
• 6.1 引言79
• 6.2 材料与方法79-81
• 6.2.1 主要试剂79
• 6.2.2 主要仪器79
• 6.2.3 压力对IFTase催化反应影响79
• 6.2.4 超高压下IFTase最适反应温度的确定79-80
• 6.2.5 超高压下IFTase最适反应pH的确定80
• 6.2.6 超高压下金属离子对IFTase催化反应的影响80
• 6.2.7 在超高压下无机盐对IFTase催化反应的影响80
• 6.2.8 超高压下IFTase催化动力学及热动力学参数计算80-81
• 6.2.9 DFAIII含量的确定及催化反应速度的计算81
• 6.2.10 数据处理81
• 6.3 结果与讨论81-89
• 6.3.1 超高压下对IFTase催化反应速度的影响81-82
• 6.3.2 超高压下IFTase催化反应最适温度的变化82-83
• 6.3.3 超高压下IFTase催化反应最适pH的变化83
• 6.3.4 超高压下金属离子对IFTase催化反应的影响83-84
• 6.3.5 超高压下无机盐对IFTase催化反应的影响84-85
• 6.3.6 在超高压下IFTase催化反应热动力学参数变化85-89
• 6.4 本章小结89-90
• 主要结论与展望90-92
• 主要结论90
• 展望90-92
• 论文创新点92-93
• 致谢93-94
• 参考文献94-103
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文103

【参考文献】

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4 战荣荣;不同启动子调控的菊糖果糖转移酶在毕赤酵母中的高效分泌表达[D];江南大学;2014年

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本文编号：1025958