基于超支化大分子的多功能纳米平台的构建及其基因治疗应用

发布时间：2017-12-08 09:31

  本文关键词：基于超支化大分子的多功能纳米平台的构建及其基因治疗应用

  更多相关文章： 超支化大分子 树状大分子 聚乙烯亚胺 金纳米颗粒 靶向分子 基因治疗 光热治疗 pDNA siRNA

【摘要】：分子生物学和纳米技术的快速发展,极大推动了纳米材料在生物医学领域中的应用,并在基因传递、光热治疗、药物输送及医学成像等方面发挥关键作用。为实现纳米技术在疾病治疗中的广泛应用,开发安全、稳定和高效的功能化纳米材料显得至关重要。各种纳米材料,包括脂质体、超支化大分子和天然高分子聚合物等已成为目前研究的热点。其中,超支化大分子因其独特的物理化学性质和结构特点,不仅为先进功能化的超支化大分子纳米材料的构建提供了理论依据,还为疾病治疗新手段的探索提供了新思路。为了优化超支化大分子(第五代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)或聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI))的生物相容性、提高载体的基因转染效率、增强材料的肿瘤杀伤效果,本论文以超支化大分子作为平台,构建了一系列基于超支化大分子的纳米颗粒用于疾病的生物学治疗,具体做了以下研究工作:一、RGD多肽功能化树状大分子包裹的金纳米颗粒负载hBMP-2 pDNA用于骨髓间充质干细胞的基因治疗;二、功能化树状大分子包裹的金纳米颗粒负载治疗性siRNA用于人恶性胶质瘤细胞的基因治疗;三、树状大分子修饰的MoS_2纳米片用于肿瘤的基因和光热治疗;四、多功能化聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒负载siRNA用于肿瘤的基因治疗。本文对制备的功能化超支化大分子进行系统性研究,一方面,积极探索基于树状大分子的纳米颗粒在多种基因治疗,甚至在光热治疗上的潜力;另一方面,开发价格低廉,可替代树状大分子的超支化大分子,为制备新型多功能纳米材料提供新的思路和发展方向。本论文的主要研究内容如下:1)第二章中,我们合成了RGD多肽修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒。具体首先通过聚乙二醇链将靶向分子rgd连接到第五代聚酰胺胺树状大分子表面,再将mpeg部分修饰到其表面,以rgd多肽修饰的聚乙二醇化树状大分子为模板,通过硼氢化钠快速还原法,按照au/g5.nh2=25的投料摩尔比,合成最终的audenps。所制备的aunps粒径为1.9-2.1nm,且分布均匀,大小均一。在n/p比大于等于1的时候,能成功将pdna完全的包裹,在此基础上选择n/p比1~5进行后续的基因转染实验。audenps复合egfplucpdna转染干细胞,通过荧光素酶表达实验可得出,n/p比为2.5的时候,材料具有最高的荧光素酶表达量,而k4具有最强的基因转染效率,绿色荧光蛋白表达实验也验证了这个结论。随后,研究audenps/hbmp-2pdna复合物在干细胞中的基因表达量、碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量和钙离子分泌量,并进行冯库萨染色。实验结果显示,干细胞的基因转染效率很大程度上取决于树状大分子表面和内部的修饰和改性。rgd多肽的修饰为载体提供了良好的细胞靶向特异性,而aunps为树状大分子提供了刚性立体三维结构,有利于载体对pdna进行压缩,提高载体的基因转染效率。这证明了本章合成的audenps是一种高效特异性的载体,可负载hbmp-2pdna成功诱导骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞。2)基于第二章的研究,第三章选择基因转染效率最高的两种audenps作为载体,负载治疗性的sirnas(vegf(血管内皮生长因子)sirna和bcl-2(b细胞淋巴瘤-2)sirna),研究audenps在u87mg细胞(人恶性脑胶质瘤细胞)中的基因转染效率,评价其对特异基因的沉默能力。研究表明,audenps/sirna复合物的水合粒径和表面电势分别约为200nm和20mv,这使得复合物更容易跨越细胞膜。在不同的树状大分子浓度(0~3000nm)和不同的n/p比(2.5~15)条件下,细胞存活率呈现明显的浓度依赖性和n/p比依赖性。即使在最高的浓度和n/p比条件下,细胞的存活率仍高达70%以上,证明材料具有良好的细胞相容性。细胞转染实验结果证实,audenps/sirna复合物在n/p比为10的时候,具有最高的荧光强度,且靶向材料的基因转染效率显著高于非靶向材料。体外和体内的蛋白印迹实验证实,在n/p比等于10的时候,audenps/sirna复合物能成功诱导特异性基因沉默,而rgd靶向的audenps基因沉默率高达70%以上。实验结果证明,制备的audenps可作为安全高效的基因治疗载体,负载治疗性的sirna应用于肿瘤的基因治疗。3)第二、三章的研究证明功能化树状大分子是一种安全高效的基因传递载体。但前期的工作表明,仅仅单一的基因治疗并不能保证完全的杀死癌细胞,只在一定程度上抑制癌细胞的生长。因此,第四章考虑结合光热治疗来实现理想的肿瘤治疗效果。mos2作为一种新型的过渡金属二硫化物无机材料,具有高的比表面积、强表面吸附特性、高的光热转换效率以及良好的生物相容性,这些独特的优点使其有潜力作为一种安全高效的新型光热剂。本章通过简单的水热法合成了类似纳米片结构的mos2,随后将表面部分修饰硫辛酸(la)的第五代聚酰胺胺树状大分子(g5-la)通过二硫键修饰到mos2表面,合成了第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼(g5-mos2)。制备的g5-mos2具有良好的胶体稳定性、光热稳定性和生物相容性,其光热转化效率高达47.8%,对癌细胞具有较大的杀伤力。将g5-mos2与bcl-2sirna复合转染4t1细胞(小鼠乳腺癌细胞),具有较高的基因沉默水平,细胞中47.3%的基因得到了沉默。而体外的光热和基因治疗效果评价结果显示,经基因和光热协同治疗的细胞存活率仅为21.02%,显著低于单独的光热治疗(45.8%)和基因治疗(68.7%)。体内的光热和基因协同治疗效果亦显示,双重治疗后,肿瘤几乎被完全消灭,大大地提高了小鼠的存活率。这些结果说明,制备的g5-mos2纳米片是一种具有良好生物相容性和血液相容性的纳米材料,能成功实现肿瘤细胞的基因和光热协同治疗。4)考虑到树状大分子高昂的成本,不利于实现产品最终的产业化生产,第五章尝试利用聚乙烯亚胺作为载体,对其进行功能化修饰。首先在pei表面共价修饰peg以及靶向分子rgd。再以之为模板,通过快速还原的方法,按照au/pei=25的投料摩尔比,合成了最终的aupenps。制备的aupenps内部的金核粒径为2.5~2.9nm,呈分布均匀的球形或半球形,具有良好的稳定性和生物相容性。auPENPs负载siRNA后,在N/P比为10的时候具有最高的基因转染效率。体内和体外的蛋白印迹实验证明,Au PENPs/siRNA复合物能抑制特定蛋白的表达,诱导癌细胞特异性的基因沉默。研究表明,合成的Au PENPs能有效的压缩siRNA,并将siRNA靶向传递到αvβ3整合素过量表达的癌细胞中,诱导特异性的基因沉默,降低靶蛋白表达水平。
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TB383.1;R450

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本文编号：1265912